牛共刺激分子CD80、CD86 SYBR Green Ⅰ荧光定量PCR检测方法的建立

（西昌学院动物科学学院，西昌 615000）

T细胞作为机体重要的免疫细胞，若想发挥其功能，就需要两种信号的刺激来使其活化。第一种刺激是T细胞抗原受体与抗原肽-MHC复合物的特异性结合，第二种刺激是抗原提呈细胞表达的共刺激分子与T细胞表面的相应受体作用提供的共刺激信号[1]。在这两种信号中，仅凭第一种信号无法引起细胞因子的分泌，也无法引起T细胞的增殖。而第二种信号，即共刺激信号，虽是非抗原依赖性的，但它决定了接受第一种信号后的T细胞到底是开始活化增殖还是转为无能[2]，对T细胞的功能表达具有至关重要的作用。B7家族分子是主要的共刺激分子，而CD80、CD86是B7家族分子的重要成员，也是近年来受到关注较多的成员。CD28、CTLA-4都是T细胞表面的受体，但CD80、CD86与它们结合后产生的效果却截然不同。前一种受体可以刺激T细胞活化，而后一种受体则会抑制T细胞活化[3]。荧光定量PCR作为一种新的定量试验技术相比于传统PCR有更多的优点，它不仅可以完成对DNA模板的定量检测，而且灵敏度更高、特异性更好、更加可靠，且没有气溶胶污染的风险[4]。目前已有很多关于使用荧光定量PCR技术来检测细胞因子的研究[5～9]。本研究旨在建立一种特异性强的SYBR Green Ⅰ荧光定量PCR方法，通过该方法能快捷检测牛共刺激分子CD80、CD86，为抗病毒相关研究提供技术支持。

1 材料与方法

1.1 试验材料

取健康牛新鲜的脾脏，加适量生理盐水后搅碎，静置，取上层液体，小分装-20℃冻存备用。

1.2 主要试剂与仪器

UNIQ-10柱式Trizol总RNA抽提试剂盒、M-MuLV第一链cDNA合成试剂盒和2×SG Fast qPCR Master Mix，均购自上海生工生物工程股份有限公司；2×Taq Plus PCR MasterMix，购自北京天根生化科技有限公司；PCR仪，为Eppendorf公司的Mastercycler nexus系列产品；荧光定量PCR仪，为德国Analytik Jena公司产品。

1.3 引物设计与合成

根据GenBank牛CD80、CD86的基因序列，分别设计引物（见表1），由上海生工生物工程股份有限公司完成引物合成。

表1 引物序列、大小及退火温度

1.4 标准品的制备

1.4.1 总RNA提取

取300μL牛脾脏组织悬浮液样品，10 000rpm离心3min，取上清300μL加至干净的1.5mL EP管中，再向其中加入500μL Trizol，充分混匀，剩余步骤参照UNIQ-10柱式Trizol总RNA抽提试剂盒说明书进行。

1.4.2 反转录

用M-MuLV第一链cDNA合成试剂盒进行总RNA的反转录。反转录体系为：5μL总RNA，2μL特异性引物（10 pmol），5μL RNase free ddH2O，轻轻混匀后离心3～5s，反应混合物在65℃温浴5min后，冰浴30s，然后离心3～5s。将反应管冰浴，再加入4μL 5×Reaction Buffer，1μL RNase inhibitor（40U/μL），2μL dNTP Mix(10mmol/L)，1μL M-MuLV RT(200U/μL)，组成20μL体系。反转录程序为：42℃ 60min；70℃10min；15℃保存。

1.4.3 CD80、CD86的PCR扩增

将得到的cDNA进行PCR扩增，PCR体系为：12.5μL 2×Taq PCR MasterMix，9.5μL ddH2O，0.5μL上游引物，0.5μL下游引物，2.0μL cDNA组成25μL体系。PCR程序为：94℃ 5min；94℃ 30s，60℃ 30s，72℃ 30s，共35个循环；72℃ 5min；4℃保存。

1.4.4 标准品构建及鉴定

PCR产物进行琼脂糖凝胶电泳，切胶，按胶回收试剂盒回收DNA片段。将纯化的DNA片段连接于pMD18-T载体上，再加入到TOP10感受态细胞进行转化，挑取阳性克隆于含有抗生素的液体LB培养基中过夜培养，提取重组质粒，进行鉴定，将鉴定为阳性的重组质粒送往上海杰李生物技术有限公司进行测序。测序正确的重组质粒作为标准品-20℃冻存备用。

1.4.5 CD80、CD86标准品浓度、纯度测定及初始拷贝数计算

测定CD80、CD86标准品的浓度、纯度，选用1.8＜A260/A280＜2.0的CD80、CD86标准品进行10倍系列稀释，稀释后置于-20℃保存备用。根据拷贝数计算公式[10]，计算CD80、CD86的拷贝数。

1.5 标准曲线建立

选取7个稀释度的标准品，进行SYBR Green Ⅰ荧光定量PCR，建立标准曲线。荧光定量PCR反应体系为：10μL 2×SG Fast qPCR Master Mix，2μL DNF Buffer，0.4μL10mM上游引物，0.4μL 10mM下游引物，5.2μL ddH2O，2μL模板 DNA。反应程序为：95℃ 3min；95℃ 5s，退火温度30s，72℃ 10s，共40个循环。在每个循环的最后一步收集荧光信号计算Ct值，根据Ct值及其对应的拷贝数的对数做标准曲线。

1.6 特异性试验

用荧光定量PCR仪对每次试验的荧光定量PCR产物作熔解曲线，观察熔解曲线是否为单一的特异峰，若曲线为单一的特异峰则表明该方法特异性良好。熔解曲线设置为：初始温度60℃，终点温度95℃，每步温度变量1℃，平衡时间15s。

1.7 重复性试验

从已经制备好的标准品中任意选取3个梯度，每个浓度设置3个重复进行组内重复性试验。间隔1d以同样的方法再重复一次试验，共重复3次，作为组间重复性试验。计算变异系数，分析离散程度，评价该方法的稳定性。若变异系数小于5%[11]，则证明所建立的荧光定量PCR方法稳定性良好。

1.8 敏感性试验

选取浓度为101～104copies/μL的标准品进行SYBR GreenⅠ荧光定量PCR，判断其敏感性。如果所检测样品在40个循环内的Ct值＞0，则判定为阳性[12]。

2 结果

2.1 标准品制备

2.1.1 标准品构建及鉴定结果

根据试验设计可知，经RT-PCR扩增得到的CD80大小应为114bp，CD86大小应为112bp。试验结果显示，经RT-PCR扩增、琼脂糖凝胶电泳后，在凝胶成像系统下看到的条带如图1，与预期条带一致。阳性重组质粒测序所得序列与参考序列比较，结果显示同源性为100%，所得片段为目的片段。

图1 CD80、CD86 PCR产物琼脂糖凝胶电泳结果

2.1.2 CD80、CD86标准品浓度、纯度及拷贝数

测定CD80、CD86的浓度、纯度，选用1.8＜A260/A280＜2.0的CD80、CD86进行10倍倍比稀释，将稀释后的标准品保存于-20℃备用。本试验中最后选用的CD80的OD260＝0.339，A260/A280＝1.88；CD86的OD260＝0.321，A260/A280＝1.82。根据拷贝数计算公式计算拷贝数，得CD80的初始拷贝数为1.379×1020copies/μL，CD86初始拷贝数为1.329×1020copies/μL。

2.2 CD80、CD86标准曲线

选取拷贝数为1012～1018copies/μL的标准品进行SYBR Green Ⅰ荧光定量PCR，得到CD80、CD86的荧光定量PCR扩增曲线（见图2），根据得到的Ct值及其对应的拷贝数的对数建立标准曲线（见图3）。结果显示见表2。

表2 CD80、CD86标准曲线数据结果

由表2可知，试验所得的相关系数均大于0.984，表明所建立的标准曲线线性良好。CD80的标准曲线线性方程为y=-3.14x+64.66；CD86的标准曲线线性方程为y=-2.96x+61.13（y表示Ct值，x表示样品浓度对数）。

图2 CD80、CD86荧光定量PCR扩增曲线

2.3 特异性试验结果

CD80、CD86的特异性试验结果如图4所示，熔解曲线显示为单一的特异峰，CD80的Tm值在80.4～80.8℃范围内，CD86的Tm值在80.2～80.9℃范围内，表明建立的荧光定量PCR方法特异性良好。

图4 CD80、CD86熔解曲线

2.4 重复性试验结果

选拷贝数为1016～1018copies/μL的3个梯度的标准品，用建立的荧光定量PCR方法进行组间及组内重复性试验，计算其变异系数。结果显示（见表3、表4）无论是CD80还是CD86，它们的所有重复性试验的变异系数均在4.71%以内，表示建立的荧光定量PCR方法稳定性良好。

表3 CD80重复性试验

表4 CD86重复性试验

2.5 敏感性试验结果

选拷贝数为101～104copies/μL的4个梯度的标准品进行荧光定量PCR，检测所建立的方法的敏感性。试验结果如图5。结果显示在浓度为10copies/μL时，CD80、CD86荧光定量PCR均有扩增曲线，且在40个循环内的Ct值＞0，故所建立的荧光定量PCR方法检出下限为10copies/μL，敏感性较高。

图5 CD80、CD86敏感性试验

3 讨论

CD80、CD86是刺激T细胞活化的一对共刺激分子，位于抗原提呈细胞表面，是B7家族的主要成员。CD80、CD86通过与T细胞表面的受体CD28结合来传递信息刺激T细胞活化，同时它们也可以与T细胞表面的抑制性受体CTLA-4结合从而抑制T细胞过度扩增。当有限的CD80、CD86表达时，因为CD80、CD86对CTLA-4的亲和力更高，故CD80、CD86主要与CTLA-4结合，抑制T细胞的进一步活化。而当大量的CD80、CD86表达时，因为CTLA-4的表达水平有限，CD28与CD80、CD86的结合逐渐变为主要趋势，从而进一步促进T细胞的活化增殖[13]。所以可以通过研究CD80、CD86的表达量来了解免疫过程[14]。故本研究建立了一种检测CD80、CD86的荧光定量PCR方法，为抗病毒相关研究奠定基础。

实时荧光定量PCR是目前确定样品中核酸拷贝数最敏感和最准确的方法，与传统的免疫学方法相比，荧光定量PCR不仅更加准确、快速，而且可以对被检测物质进行定量检测，拥有其他方法不具备的优势，故可借助此方法研究CD80、CD86表达量的变化。

在本次试验中采用的是SYBR GreenⅠ荧光定量PCR。为减少干扰因素的影响，在荧光定量PCR后进行熔解曲线的绘制，通过熔解曲线来分析所建立的方法的特异性。当熔解曲线只有一个特异峰时表明所建立方法特异性良好，无引物二聚体及非特异性扩增产物。试验结果显示CD80、CD86的熔解曲线均只有一个特异峰，表明所建立的荧光定量PCR方法特异性良好，无引物二聚体及非特异性扩增产物的产生。

为了验证所建立的方法的稳定性，保证方法的可重复性，对所建立的荧光定量PCR方法进行组内、组间重复性试验，计算、分析其变异系数，当变异系数小于5%时表明建立的方法稳定性好，可重复性高。本次试验结果显示CD80、CD86荧光定量PCR的所有重复性试验的变异系数均在4.7%以内，所以建立的SYBR GreenⅠ荧光定量PCR方法稳定性良好。

荧光定量PCR技术是目前检测样品中核酸拷贝数最敏感的方法，为检测本试验所建立的荧光定量PCR方法的敏感性，取拷贝数为101～104copies/μL的4个梯度的标准品进行荧光定量PCR，如果所检测标准品在40个循环内的Ct值＞0，则认为所建立的荧光定量PCR方法在该拷贝数时仍能检测出目标因子。结果显示在浓度为10copies/μL时荧光定量PCR仍有扩增曲线，且在40个循环内的Ct值＞0，故所建立的荧光定量PCR方法检出下限为10copies/μL，敏感性较高。

本次试验所建立的SYBR Green Ⅰ荧光定量PCR方法特异性、稳定性良好，敏感度较高，为抗病毒研究提供了技术平台。