温州市食源性弯曲菌耐药特征与分子分型研究

章乐怡，楼辉煌，胡玉琴，王黎荔，缪蔚蔚，李 毅，吴跃进

弯曲菌(Campylobacter)是人兽共患病原菌，也是主要的食源性病原菌。导致人类弯曲菌病的弯曲菌属主要菌种是空肠弯曲菌和结肠弯曲菌(90%以上)[1]。空肠弯曲菌的自然宿主主要是禽类和鸟类，也可从猪、牛等哺乳动物中分离到[2]，家禽通常被认为是人类感染弯曲菌病的最常见来源[3]。处理或食用生肉或未煮熟的肉类产品，通常会导致疾病[4]。人感染后可引起弯曲菌病，主要症状为腹泻性肠炎，以腹泻、腹痛和发烧为主，虽然空肠弯曲菌感染多为自限性疾病，但20%以上的患者会出现病情反复或病程延长现象，严重者会并发吉兰-巴雷综合征(guillain-barré syndrome，GBS)[5]。2007年在中国吉林曾发生空肠弯曲菌疫情，有32例被确认为GBS患者[6]。弯曲菌引起的肠炎被认为是发达国家及发展中国家最常见的细菌性肠炎之一，在欧美等国家，报道最多的食源性疾病是弯曲菌病，其发病率已超过了沙门菌、志贺菌以及李斯特菌[7]。美国每年约有150万人次患弯曲菌病，而且多达40%的吉兰-巴雷综合征病例可能是弯曲菌感染引起[8]。在耐药方面，近年来不同来源的弯曲菌的耐药性在明显增强[9-10]。2016年欧盟抗生素耐药性数据显示，从人类和鸡中分离的弯曲菌对环丙沙星和四环素耐药性呈上升趋势，有些达到极高的耐药性[11]。2013年，美国CDC将耐氟喹诺酮类和大环内酯类弯曲菌列为影响公共卫生的耐药威胁之一[12]。印度的文献报道显示，从腹泻病人中分离到的菌株对萘啶酸耐药率为100%，对环丙沙星的耐药率为86.66%，耐3 种或3 种以上抗生素的菌株占41.66%[13]。我国文献报道234 株空肠弯曲菌中萘啶酸耐药率为93.16%，环丙沙星耐药率为90.17%[14]。

故在本市进行弯曲菌病例监测，了解温州市食源性疾病弯曲菌感染现状，获得弯曲菌分离株的耐药特征，建立本地弯曲菌分子分型数据库，对温州市预防和控制弯曲菌病的发生和发展及对弯曲菌病的防治提供新思路及科学依据。

1 材料与方法

1.1腹泻病例调查 在2017年11月至2019年7月期间，对温州市2所食源性疾病监测哨点医院主动就诊的符合食源性疾病腹泻病例定义的患者进行个案调查和采样。两所哨点医院包括1所市本级的三甲医院和1所县区级的二乙医院。采集粪便标本送至本中心的实验室进行弯曲菌检测。

1.2主要仪器与试剂 Mastercycler○Rep gradient S梯度PCR仪为德国艾本德产品；Qsep100全自动核酸蛋白分析系统-毛细管电泳仪购自台湾BIOptic(光鼎)公司；双孔滤膜法弯曲菌培养基(ZC-CAMPY-001)、弯曲菌六重PCR试剂盒(ZC-CAMPY-004)、弯曲菌琼脂稀释法抗生素最低抑菌浓度(MIC)检测试剂盒(ZC-AST-001)购自青岛中创生物科技有限公司；MLST 7个管家基因由杭州擎科生物科技有限公司合成。

1.3 实验室检测

1.3.1弯曲菌分离培养 本研究采用滤膜法分离空肠弯曲菌[15]。挑取适量粪便标本放入弯曲菌促生长增菌液中增菌后，取300 μL转入双孔滤膜板滤膜上，两块滤膜分别置于哥伦比亚血平板和 Karmali平板上，微需氧条件下42 ℃微需氧环境下培养48 h，镜检形态为G-、弧形、S形或螺旋形等可疑菌落分纯后进一步进行生化鉴定。生化鉴定参照 GB 4789.9-2014[16]进行试验。

1.3.2PCR分型鉴定 采用弯曲菌六重PCR法检测试剂盒进行弯曲菌分型。通过多重PCR核酸检测的方法，针对弯曲菌属、种特异性基因核酸片段进行扩增。用于检测弯曲杆菌属、空肠弯曲菌、结肠弯曲菌、胎儿弯曲菌、红嘴鸭弯曲菌和乌普萨拉弯曲菌，他们的目标基因分别是16s rRNA、MapA、glyA-C.coli、sapB2、glyA-C.lari和cdtB，目的片段分别为816 bp、589 bp、126 bp、435 bp、251 bp和342 bp。PCR循环参数：94 ℃预变性5 min，94 ℃ 1 min、55 ℃ 1 min、72 ℃ 2 min，循环35次，72 ℃延伸5 min，扩增后用Qsep100全自动核酸蛋白分析系统-毛细管电泳仪对条带进行分析。

1.3.3MLST 分子分型 利用7 个管家基因对空肠弯曲菌和结肠弯曲菌进行分子分型。弯曲菌7 个管家基因包括aspA、glnA、gltA、glyA、pgm、tkt和uncA，扩增引物、测序引物及扩增条件参照MLST 数据库(http: //pubmlst．org /campylobacter/)，反应程序为 94 ℃ 5 min 预变性，随后94 ℃ 30 s，50 ℃退火 30 s，72 ℃延伸45 s，共35 个循环。扩增产物由杭州擎科生物科技有限公司进行测序，将测序结果上传到 MLST 数据库获取每个菌株7 个管家基因的等位基因编号，根据等位基因编号确定ST型及克隆群(clonalcomplex，CC)。与数据库比对后数据库中没有的ST型则为新发现的ST型。最后根据已获得的ST型使用BioNumeric软件进行聚类，生成空肠弯曲菌和结肠弯曲菌的最小生成树。

1.3.4药敏试验 根据CLSI推荐的弯曲菌琼脂稀释法(Agar Dilution Method)对菌株进行药敏试验，采用商品化的弯曲菌琼脂稀释法检测盒进行试验。抗菌药物包含了7大类11种，具体为大环内酯类：红霉素(Erythromycin，ERY)、阿奇霉素(Azithromycin，AZI)；氨基糖苷类：庆大霉素(Gentamicin，GEN)、链霉素(Streptomycin，STR)；氯霉素类：氯霉素(Chloramphenicol，CHL)、氟苯尼考(Florfenicol，FLO)；喹诺酮类及氟喹诺酮类：萘啶酸(Nalidixic acid，NAL)、环丙沙星(Ciprofloxacin，CIP)；四环素类：四环素(Tetracycline，TET)；林可酰胺类：克林霉素(Clindamycin，CLI)；酮内酯类：泰利霉素(Telithromycin，TEL)。空肠弯曲菌ATCC33560作为质控菌株。42 ℃微需氧培养48 h后读结果。记录弯曲菌对各类药物的最低抑菌浓度值(MIC值)，根据美国NARMS(National Antimicrobial Resistance Monitoring System)标准(https://www.cdc.gov/narms/antibiotics-tested.html)及文献报道对弯曲菌的耐药性进行判定[17]。

1.4统计分析 使用SPSS20.0软件进行统计学分析，计数资料的比较应用卡方检验，P<0.05为差异有统计学意义。

2 结 果

2.1流行病学分析 对2017年11月至2019月7月间食源性疾病病例定义患者样本进行了弯曲菌检测，其中男性509 例，女性400 例，年龄为1月龄～91岁。弯曲菌病例调查显示，患者均有不同程度的腹泻，以水样便居多，2 例黏液便，1 例脓血便，腹泻次数3～20 次不等，5 例伴发热(体温37.5～39.3 ℃)，3 例伴呕吐。弯曲菌的总阳性率为10.2%(93/909)，2018、2019年阳性率分别为 11.5%、9.0%，差异无统计学意义(χ2=1.37,P>0.05)。其中空肠弯曲菌阳性率为8.9%(81/909)，结肠弯曲菌阳性率为1.3%(12/909)，二者差异有统计学意义(χ2=53.954,P<0.05)，见表1。按年龄分为6 个组,分别为0～14 岁组、15～30 岁组、31～45 岁组、46～60 岁组、61～75 岁组和76～91 岁组。各年龄组间阳性率差异无统计学意义(χ2=2.09,P>0.05)，见表2。按季节统计，每个季节均检出弯曲菌，春季(3-5月)阳性率为10.5%(31/295)、夏季(6-8月)阳性率为8.6%(15/175)、秋季(9-11月)阳性率为9.9%(10/101)，冬季(12-次年2月)阳性率为11.0%(37/337)。不同季节弯曲菌阳性率差异无统计学意义(χ2=0.468,P>0.05)。

表1 温州市食源性疾病患者不同年份弯曲菌检出情况Tab.1 Detection of Campylobacter in foodborne patients in different years in Wenzhou

表2 温州市食源性疾病患者不同年龄弯曲菌检出情况Tab.2 Detection of Campylobacter in foodborne patients in different ages in Wenzhou

2.2弯曲菌分离株的耐药情况 本研究共对93 株腹泻病人中检出的弯曲菌进行了药敏试验，对7大类11种抗生素的耐药率结果见表3，其中空肠弯曲菌和结肠弯曲菌多重耐药率(耐3种以上抗生素)分别为42.0%(34/81)、50.0%(6/12)。空肠弯曲菌与结肠弯曲菌多重耐药率差异无统计学意义(χ2=0.275，P>0.05)。空肠弯曲菌对萘啶酸、环丙沙星和四环素的耐药率分别为93.8%(76/81)、92.6%(75/81)、85.2%(69/81),结肠弯曲菌对萘啶酸、环丙沙星和四环素的耐药率分别为91.7%(11/12)、100%、100%。

93 株弯曲菌对11 种抗菌药物共产生了22 种耐药谱，对11 种药全耐的1 株菌为结肠弯曲菌，耐NAL-CIP-TET谱型的最多，占38.7%(36/93)，耐NAL-CIP-TET-FLO谱型的占21.5%(20/93)。NAL-CIP-TET和NAL-CIP-GEN-TET是空肠弯曲菌和结肠弯曲菌共有的耐药谱型。见图1。

表3 93株弯曲菌分离株对11种抗菌药物的耐药率Tab.3 Drug resistance rate of 93 Campylobacter isolates against 11 antimicrobial agents

图1 93株弯曲菌分离株对11种抗菌药物的耐药谱Fig.1 Resistance of 93 Campylobacter isolates against 11 antimicrobial agents

2.3弯曲菌分离株MLST分子分型检测 93株弯曲菌分离株中，空肠弯曲菌被分成54 种ST型，其中32 种ST型归为15 种克隆群(Clonal Complex，CC)，未归类的ST型为22 种，其中新发现的ST型为14 种。构成比最高的CC为ST45CC，占11.1%(9/81)，其次是ST464CC、ST21CC，分别占9.8%(8/81)、8.6%(7/81)，最多的ST型为ST3578，为5株，其次是ST137、ST464、ST6607，均为4 株。

12 株结肠弯曲菌包含8 种ST型，其中6 种ST型归为同一克隆群ST828CC，共包含了10 株，一种ST型未被分配克隆群。新发现的ST型为2 种。见图2。

注：在最小生成树中，圆圈周围的数字代表弯曲菌MLST型别，圆圈的大小表示这个ST型的分离株数量。带*号ST型的表示是数据库中没有本研究新发现的ST型。红色圆圈代表结肠弯曲菌，蓝色圆圈代表空肠弯曲菌。图2 93株弯曲菌分离株的最小生成树Fig.2 Minimum spanning tree of 93 Campylobacter isolates

3 讨 论

近年来弯曲菌感染已经成为发达国家细菌性食源性疾病的主要原因，食源性弯曲菌感染的数量已超过沙门菌。 随着我国各地空肠弯曲菌感染呈上升趋势，陆续有聚集暴发病例出现，弯曲菌也慢慢成为我国最重要的腹泻病原菌之一。本研究对温州市区两家医院的腹泻病人进行弯曲菌的监测分析并对菌株进行多位点序列分型和药敏试验。909例的病例监测结果表明温州市弯曲菌阳性率为10.23%，高于同一时期温州市两家监测点医院食源性沙门菌的阳性率0.9%(18/1 909)(χ2=140.396，P<0.05 )；与食源性副溶血弧菌的阳性率8.1%(155/1 909)差异无统计学意义(χ2=3.421，P>0.05)，也高于上海腹泻病例弯曲菌阳性率5.02%[18]和河南腹泻病例弯曲菌检出率6.3%[19]。结合流行病学显示温州市弯曲菌感染的食源性病例中不同年龄段的阳性率无统计学差异，不同季节的阳性率也无明显差异。与其他报道弯曲菌夏秋季检出为主、且空肠弯曲菌肠炎患者以婴幼儿多见(50%)有所不同[19]。但本研究中病人中空肠弯曲菌检出率(8.9%)明显高于结肠弯曲菌(1.3%)，同北京、上海的报道一致[15，18]。有报道过滤富集法是从腹泻患者粪便标本中分离弯曲菌最有效的方法，滤膜法检出率高于传统的Karmali 选择性平板[20]，因而本文采取了经增菌的滤膜法，检出率得到大幅度地提高。

文献报道弯曲菌对喹诺酮类、四环素类抗生素的耐药率表现很高的耐药性[14，21]。本研究药敏试验结果也证实了这个结论，分离菌株表现出耐药谱型的多样性，共产生了22种耐药谱，以萘啶酸-环丙沙星-四环素耐药谱型为优势耐药谱，对这3种药物的耐药率分别达到93.5%、93.5%、87.1%。空肠弯曲菌和结肠弯曲菌多重耐药率分别为 42.0%、50.0%。结肠弯曲菌对大环内酯类、氨基糖苷类耐药率均高于空肠弯曲菌(χ2=21.594，P<0.05)、(χ2=23.357，P<0.05)，其中结肠弯曲菌对大环内酯类的耐药率均达到33.3%以上，而空肠弯曲菌对这两大类的耐药率均低于10%。33.3%的结肠弯曲菌分离株对9种以上的药物耐药，1株菌对11种药物全部耐药。而北京和上海的腹泻病例中结肠弯曲菌的红霉素、链霉素、庆大霉素的耐药率更高，分别达到61%、72%、59%[22]。大环内酯类抗生素是目前临床推荐治疗弯曲菌感染的一线用药，而结肠弯曲菌的多重耐药已经不可忽视，对大环内酯类的高耐药率将给临床治疗带来新的考验。人源弯曲菌的耐药现状可能与抗生素在临床和兽医药中的使用不规范有关[23]。

多位点序列分型方法具有高分辨率、重复性好，且能实现数据全球共享。本研究结果显示，温州市弯曲菌菌株总体呈现遗传多态性、多个克隆株共存的现象。不同弯曲菌呈现不同的基因特征，空肠弯曲菌与结肠弯曲菌遗传关系相差甚远。空肠弯曲菌呈复杂的遗传多样化，93株弯曲菌分离株分为54 种ST型，中间包含了15种克隆复合物。而结肠弯曲菌分离株遗传变异上相对保守，83.3%(10/12)属于ST828CC，这与文献[22]报道(86%)一致。结肠弯曲菌中发现一株ST1121，在国内文献中较少见，在数据库中发现荷兰和英国均提交过这个ST型的病人株。空肠弯曲菌ST45已经被认为与人类神经系统疾病(GBS)有关[24]，在我们的研究中病人株ST45CC是占比最多的，其中就有ST45。数据库中显示属于ST45CC中的ST137、ST45来源于各种宿主，如人、禽肉、狗、羊、鸟、环境水中均有,说明这个克隆群有广泛的宿主范围，并且对环境适应良好。空肠弯曲菌ST464 曾是北京某区2016-2017年腹泻病例中分离空肠弯曲菌的优势 ST 型[20]，而在本研究中ST464CC也是仅次于ST45CC的一个克隆群，其中ST464也占了4株。本研究提交了16种新ST型别，丰富了全球弯曲菌数据库，其中7种新的ST型与其他分离株亲缘关系较远，另9种均可以在我们本地分离株中找到相同的克隆群。

通过聚类分析我们经常发现相同 ST 的菌株，相同 ST 型往往被认为是同一克隆菌株感染，提示有聚集性病例的可能。在本研究中都是散发病例，但这种方法的建立将有利于研究今后本地区的聚集性食源性疾病的溯源。

利益冲突：无