产前超声诊断胎儿房室间隔缺损及基因检测分析

谷孝艳，杨喜惠，郝晓艳，张 烨，孙 琳，韩建成，刘晓伟，何怡华*

(1.首都医科大学附属北京安贞医院超声科 胎儿心脏病母胎医学北京市重点实验室，北京 100029；2.中国新疆维吾尔自治区妇幼保健院超声科，新疆 乌鲁木齐 830001)

房室间隔缺损(artioventricular septal defect, AVSD)是心内膜垫发育异常导致的一组心脏畸形，在活产儿中的发生率为0.024%～0.031%[1]。目前产前AVSD检出率已达57%～92%[2-3]。AVSD常与染色体异常相关，尤其唐氏综合征，其在唐氏综合征患儿中的发生率比染色体正常儿童高1 000倍。随着基因测序技术的发展，对胎儿AVSD遗传学检测不再局限于染色体水平，可有更多、更精准的发现，如单基因突变。本研究评估胎儿AVSD的分型及其合并心内及心外畸形，并以二代测序技术低深盖度全基因组测序及全外显子测序检测AVSD基因的特征。

1 资料与方法

1.1 一般资料 回顾性分析2013年9月—2017年6月首都医科大学附属北京安贞医院超声产前检查资料，孕妇年龄21～35岁，平均(28.3±3.5)岁；共21 179胎，孕周为16～37周，平均(25.0±5.9)周；共诊断150胎AVSD，47胎具有遗传学检测结果。

1.2 仪器与方法 采用GE Voluson E8/E10彩色多普勒超声诊断仪进行胎儿超声心动图检查，频率4～8 MHz 2D/3D容积探头，按美国超声心动图协会胎儿超声心动图检查指南进行规范化操作。由2名具有5年以上超声心动图诊断经验的副主任医师分析图像，评估AVSD分型及其合并畸形。

以DP318基因组提取试剂盒[天根生化科技(北京)有限公司]进行遗传学检测。取引产胎儿脐带组织，同时抽取父母外周静脉血各5 ml(乙二胺四乙酸抗凝)，即刻置于-80°C冰箱冷冻，并送检进行低深度全基因组测序及全外显子测序。按照试剂盒步骤说明提取胎儿脐带组织的基因组DNA(gDNA)。基因测序分2步完成：先以低深度全基因组测序，测序平台为Illumina Hiseq 2500，检测100 kb以上的拷贝数变异，对检出的染色体异常进行注释，并根据DGV(http://dgv.tcag.ca/dgv/app/home)、Decipher(https://decipher.sanger.ac.uk/)、OMIM(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/omim)数据库综合分析检出的变异；之后采用全外显子组测序序列捕获技术测序，捕捉全基因组外显子区域DNA，富集后进行外显子目标区域捕获测序(Illumina Hiseq 2500，测序类型:PEl00 bp)，对原始测序数据进行低质量过滤，采用标准生物信息分析流程检测单核苷酸变异和小的插入缺失，对变异位点进行检出、过滤和注释。变异位点过滤标准包括人群数据库中频率(ExAC或千人基因组)<5%、最小覆盖深度为10 X，变异功能变化(非同义突变、剪切位点变化、无义突变、移码突变等)等。最终对变异的家系进行Sanger测序验证。

以上检查均经孕妇及家属同意，并签署引产胎儿生物标本提取及遗传学检测知情同意书。

2 结果

2.1 产前超声心动图 47胎AVSD中，7胎(7/47,14.89%)为部分型AVSD，2胎(2/47,4.26%)为过渡型AVSD，38胎(38/47,80.85%)为完全型AVSD(图1)。38胎完全型AVSD中，10胎(10/38，26.32%)为非均衡型AVSD，28胎(28/38，73.68%)为均衡型AVSD。

图1 孕妇30岁，妊娠24周，胎儿完全型AVSD A.胎儿超声心动图四腔心切面图示十字交叉消失(RA:右心房；RV:右心室；LA:左心房；LV:左心室)； B.彩色多普勒图像示共同房室瓣反流

13胎(13/47，27.66%)合并单纯心内畸形，5胎(5/47，10.64%)合并单纯心外畸形，14胎(14/47，29.79%)合并心内及心外畸形，15胎(15/47，39.91%)无合并心内及心外畸形。共27胎存在心内畸形(27/47，57.45%)，其中23胎(23/27，85.19%)锥干系统畸形，包括11胎右室双出口(11/23，47.83%)、4胎(4/23，17.39%肺动脉闭锁)、2胎肺动脉狭窄(2/23，8.70%)、4胎大动脉转位(4/23，17.39%)、1胎左肺动脉悬吊(1/23，4.35%)和1胎共同动脉干(1/23，4.35%)；2胎肺静脉畸形引流(2/27，7.41%)，2胎主动脉缩窄(2/27，7.41%)。

47胎AVSD中，18胎完全型AVSD、1胎部分型AVSD，共19胎合并心外畸形(19/47，40.43%)，包括内脏异位17胎(17/19，89.47%)和头部淋巴管囊肿(1/19，5.26%)及双手足内翻并多指/趾畸形各1胎(1/19，5.26%)。

2.2 基因检测 对47胎脐带组织提取DNA建库，其中4胎组织降解。43胎接受低深度全基因组测序及全外显子测序，结果显示22胎(22/43，51.16%)基因阳性，包括11胎21三体，2胎18三体(图2)，1例13三体，2胎染色体大片段重复，6胎单基因突变。单基因突变包括CCDC14、EVC、PQBP1、ZFPM2、ARMC4、DNAH11。

图2 孕妇30岁，妊娠24周，胎儿完全型AVSD A.胎儿脐带组织低深度全基因组测序分析电子核型图示18号染色体大片段重复； B.胎儿脐带组织低深度全基因组测序结果示意图示18号染色体拷贝数明显增多

27胎AVSD合并心内畸形，其中11胎(11/27，40.74%)基因检测结果阳性；19胎AVSD合并心外畸形，其中15胎(15/19，73.68%)基因检测结果阳性；14胎AVSD合并心内及心外畸形，其中11胎(11/14，78.57%)基因检测结果阳性。

3 讨论

AVSD是胚胎发育过程中心内膜垫发育异常所致先天性心脏畸形，主要特征为房室瓣周围间隔组织部分缺如及房室瓣发育异常；根据间隔水平分流情况分为部分型、过渡型及完全型AVSD[4-5]。胎儿AVSD与染色体非整倍体关系密切，尤其21三体，约40%的AVSD胎儿合并21三体[6]，而AVSD为21三体患者最常见畸形，提示一旦超声发现胎儿AVSD，非常有必要进行遗传学检测。

本研究采用超声心动图评估胎儿AVSD分型及其合并畸形，并分析二代测序技术低深度全基因组测序及全外显子测序检测AVSD基因的特点，以期为制定围产期管理策略提供依据。活产儿AVSD发生率0.024%～0.031%[1]，胎儿期AVSD发生率尚未见报道。本组胎儿期AVSD发病率0.71%(150/21 179)，可能与本院为胎儿心脏病转会诊中心有关；且一经诊断胎儿AVSD，大部分孕妇选择终止妊娠，而AVSD胎儿可能胎死宫内，使得本组胎儿期AVSD发病率明显高于活产儿。本组超声心动图明确诊断胎儿AVSD后，均提示孕妇接受母胎医学会诊及咨询；基于对预后及可能发生的遗传学异常的了解，大部分孕妇及家庭选择终止妊娠。

本组47胎AVSD接受遗传学检测，超声诊断时孕周为16～37周，平均(25.0±5.9)周，其中80%为22周超声排查畸形发现异常而经胎儿超声心动图专项检查检出。超声可于妊娠早期发现AVSD，常在彩色多普勒检查基础上联合其他危险因素，如颈项透明层增加、三尖瓣反流、异常静脉导管血流频谱及母体血清学检测异常等进行提示性诊断，再以有创检查如羊水穿刺等进行染色体非整倍体检测[2,7]。对妊娠早期检查未见异常的大部分胎儿AVSD，超声诊断时间为孕18～24周，即在中孕期排畸检查时发现异常后经胎儿心脏专项检查诊断。

随着技术的发展，目前胎儿超声心动图对18～24周胎儿AVSD已不易漏诊，但需注意合并心内外畸形。AVSD胎儿易合并心内畸形，王琰等[8]报道其发生率为67.6%，以锥干系统畸形发生率最高；缪伟等[9]发现胎儿AVSD发生大血管畸形的概率53.6%，本研究结果与之相近，提示产前诊断AVSD时应警惕其他心内畸形，尤其锥干系统畸形。完全型AVSD发生心外畸形的概率约57.4%[8]，主要包括胎儿水肿、颈部淋巴管囊肿、胎儿鼻骨发育不良、内脏反位、十二指肠闭锁或狭窄等[8,10]。本研究中40.43%的AVSD胎儿合并心外畸形，其中89.47%为内脏异位，其他系统畸形发生率低，推测与本组进行胎儿心脏专项检查时孕周为(25.0±5.9)周有关：妊娠早期检出的AVSD胎儿可能存在多系统畸形，后经遗传学检测明确诊断；而不存在多系统畸形的AVSD胎儿多于孕22～24周经心脏专项检查发现心脏结构异常而获得明确诊断，此时其他系统畸形往往不明显，而心脏异常相关的内脏异位发生率高。

以往胎儿异常遗传学检测多局限于染色体层面[11]。随着基因测序技术的发展，特别是二代测序技术的快速发展，目前对于AVSD的遗传学检测趋于精准深入。既往研究[12]认为约1/4唐氏儿合并AVSD，58%的完全型AVSD与21三体相关，亦常合并其他染色体异常，如18三体，13三体，22q11微缺失，8p21-p23缺失，46XY等，或为某一综合征的心脏表现，如Charge综合征，其致病基因系CHD7，75%合并先天性心脏病，最常见者为法乐氏四联症和完全型AVSD；Noonan综合征致病基因系PTPN11，约18.3%合并完全型AVSD；部分型AVSD常与Ellis-van Crevel(EVC)综合征相关，其致病基因系EVC/EVC，50～60%存在心脏异常，最常见者为单心房、AVSD及肺静脉畸形引流[2,7]。

AVSD亦可单发，即不作为某综合征的心脏表型，或不合并其他表型，其遗传学机制可能为多因素遗传或新发变异，发生率为1/10 000[13]，已发现主要致病基因为ALK3、BMP4、GATA4、CRELD1、NKX2.5等[14-15]。本研究采用低覆盖度全基因组测序及全外显子测序发现AVSD的遗传学异常不仅包括非整倍体、染色体大片段重复，同时存在单基因突变，包括CCDC14、EVC、PQBP1、ZFPM2、ARMC4、DNAH11，进一步证实AVSD基因改变可能发生在不同基因水平，同时受多因素影响；AVSD合并心内畸形胎儿基因检测结果阳性率40.74%，合并心外畸形胎儿基因检测结果阳性率高达73.68%，高度提示AVSD合并心外畸形胎儿更多存在基因异常。

综上所述，胎儿AVSD、尤其完全型AVSD易合并心内外畸形。AVSD胎儿基因异常发生率较高，合并心外畸形时更易合并染色体异常，产前超声诊断AVSD后应行遗传学检测。二代测序技术有助于发现不同水平基因异常。