半边旗总黄酮对小鼠脑缺血再灌注损伤的保护作用及机制研究

何晓文 陈品超 邹燕 张女华 陈驹

脑血管疾病为人类三大死亡原因之一，其具有发病率、致死率、致残率、复发率和治疗费用高等特点，故其严重成胁人类健康和财产［1］，目前中国脑血管病患者约800万人，平均每年约有160万新发脑血管病患者，平均每10秒钟就有一位脑血管病患者产生，可见其患病人数和发病率不容忽视［2］。然而缺血性脑血管病占全部脑血管病的85%［3］，而脑卒中又占缺血性脑血管病50%以上［4，5］，可见目前缺血性脑卒中是研究的重中之重。临床上，针对于此类疾病一般采用西药治疗［6］，但是效果并不理想，中药物种繁多，作用相对温和，一般具有安全、低毒、有效等特点，具有多重性和复杂性的作用机制，充分显示中医药是通过多组分、多层次、多靶点等作用优点，而中药有效部位避开了中药复方组分复杂、有效成分分析困难、生物利用度低等弱点，其优势显得更加明显，因而从中药寻找具有防治脑缺血再灌注损伤的有效成分是可行且必须的。

1 材料与方法

1.1 实验动物 选择144只C57小鼠，雌雄各半，体重18～22 g，随机分为假手术组、模型组、阳性对照组及低、中、高剂量组，每组24只。

1.2 半边旗黄酮成分的提取 参考相关文献，具体方法如下：称取具有质量保证的半边旗干燥全草，使用植物粉碎机粉碎，分别采用乙醇作为溶剂对不同浓度(30%、60%、90%)、不同用量(2倍、4倍、8倍体积)、不同提取时间(2、4、8 h)，按3因素正交实验法设计优选出最佳提取工艺。回收乙醇得半边旗醇提取物浸膏，再以浸膏为原料依次使用石油醚、氯仿、乙酸乙酯进行提取，将乙酸乙酯提取液蒸干即得半边旗黄酮粗品，最终通过薄板层析与高效液相色谱-质谱联用分析鉴定黄酮成分。

1.3 小鼠大脑中动脉缺血再注损伤模型的建立 利用血管内线栓插线法建立小鼠大脑中动脉缺血再灌注模型，具体方法如下：腹腔注射戊巴比妥钠40 mg/kg麻醉小鼠并仰卧固定于手术台，37℃ 维持体温，剪去颈部鼠毛，依次使用碘伏消毒液和75%酒精消毒颈部皮肤，切开颈部皮肤，小心暴露左侧颈总动脉(CCA)约0.5 cm，分离并结扎颈外动脉(ECA)，于CCA近心端打一死结，上端打一活结。于体式显微镜下用显微剪于CCA靠近死结端剪一小口，并用线栓插入CCA，打开活结，通过ICA进入大脑中动脉，缝合颈部皮肤，碘伏消毒液消詩伤口。缺血30 min后，拔出线栓，再灌注23.5 h。

1.4 半边旗黄酮成分对小鼠大脑中动脉缺血再灌注损伤的影响 低、中、高剂量组于造模前3 d连续灌胃分别给予半边旗总黄酮20、40、80 mg/(kg·d)，阳性对照组于造模前3 d连续灌胃给予阿司匹林50 mg/(kg·d)，假手术组、模型组灌胃给予等量生理盐水。其中每组8只小鼠用于神经功能缺损评分和大脑梗死体积观察(TTC染色)，每组另8只小鼠用于脑匀浆抗氧化指标和炎症指标检测，每组剩下最后8只小鼠用于血脑屏障功能检测。

1.5 观察指标

1.5.1 神经功能缺损评分 按照 Zea longa神经功能5分评分方法评分。

1.5.2 大脑梗死体积占比测定 处死小鼠小心取出大脑，于生理盐水中清洗干浄，冠状切片，第一刀在脑前极与视交叉连线中点处，依次连续切4刀，成5片，每片厚约2 mm。迅速将脑片置于0.05%TTC溶液中避光染色，37℃ 孵育30 min［7］。30 min后，将脑片置10%福尔马林中固定30 min，扫面仪扫描。利用image图像处理软件求出梗死区域占大脑总体积的百分比，即梗死体积占比。

1.5.3 脑组织匀浆SOD、CAT活性及MDA含量检测左侧脑组织称重后按体重体积比1：9加入冰冷的生理盐水，于冰浴上用超声匀浆机匀浆，制成10%的匀浆液，3000 rpm离心10 min，取上清液按SOD、CAT、MDA说明书检测步骤进行测定。

1.5.4 TNF-α 和IL-1β 含量测定 取上述适量脑组织匀浆，加上蛋白酶抑制剂苯甲基磺酰氟200 μM，30000 g离心60 min，按酶联免疫法试剂盒说明书检测步骤检测TNF-α、IL-1β 含量。

1.6 统计学方法 采用SPSS15.0统计学软件对研究数据进行统计分析。计量资料以均数±标准差()表示，采用t检验。P＜0.05表示差异具有统计学意义。

2 结果

2.1 各组神经功能缺损评分及大脑梗死体积占比比较阳性对照组神经功能缺损评分低于模型组，大脑梗死体积占比小于模型组，但差异无统计学意义(P＞0.05)；低、中、高剂量组小鼠血清中神经功能缺损评分低于阳性对照组，大脑梗死体积占比小于阳性对照组，差异具有统计学意义(P＜0.05)。高剂量组小鼠血清中神经功能缺损评分低于低、中剂量组，大脑梗死体积占比小于低、中剂量组；中剂量组小鼠血清中神经功能缺损评分低于低剂量组，大脑梗死体积占比小于低剂量组，差异具有统计学意义(P＜0.05)。见表1。

表1 各组神经功能缺损评分及大脑梗死体积占比比较()

表1 各组神经功能缺损评分及大脑梗死体积占比比较()

注：与模型组比较，aP＞0.05；与阳性对照组比较，bP＜0.05；与低剂量组比较，cP＜0.05；与中剂量组比较，dP＜0.05

2.2 各组SOD、CAT活性及MDA、TNF-α、IL-1β含量比较 阳性对照组小鼠血清中SOD、CAT活性高于模型组，MDA、TNF-α、IL-1β 含量低于模型组，但差异无统计学意义(P＞0.05)；低、中、高剂量组小鼠血清中的SOD、CAT活性高于阳性对照组，MDA、TNF-α、IL-1β 含量低于阳性对照组，差异具有统计学意义(P＜0.05)；高剂量组小鼠血清中的SOD、CAT活性高于低、中剂量组，MDA、TNF-α、IL-1β 含量低于低、中剂量组；中剂量组小鼠血清中的SOD、CAT活性高于低剂量组，MDA、TNF-α、IL-1β 含量低于低剂量组，差异具有统计学意义(P＜0.05)。见表2。

表2 各组SOD、CAT活性及MDA、TNF-α、IL-1β 含量比较 ()

表2 各组SOD、CAT活性及MDA、TNF-α、IL-1β 含量比较 ()

注：与模型组比较，aP＞0.05；与阳性对照组比较，bP＜0.05；与低剂量组比较，cP＜0.05；与中剂量组比较，dP＜0.05

3 讨论

脑血管疾病为人类三大死亡原因之一，其具有发病率、致死率、致残率、复发率和治疗费用高等特点，严重影响了患者的生活质量及沉重的经济压力。半边旗又是我国常用的中药材，有解毒、生肌、止血、消肿之功效，广泛用于治疗外伤出血、疗疮、吐血、跌打损伤、发背、目赤肿痛等［9］，具有潜在巨大的医药价值。

正常生物体内自由基生成与清除处于动态平衡，脑缺血时，氧供应不足，大量的自由基生成，使脑内脂质过氧化作用加强，导致细胞及细胞屏障损害，神经元坏死或凋亡，引起和加重缺血脑组织水肿。再灌注恢复组织氧供应，也提供了大量电子受体，使氧自由基在短时间内爆发性增多［10］。因此SOD活性往往会作为TNF-α、IL-1β 作为炎症反应及免疫应答的重要调节因子，参与损伤过程，加重脑损伤。

综上所述，成功提取产量较多半边旗总黄酮，成功建立小鼠脑中动脉缺血再灌注损伤模型，给予高、中、低剂量的半边旗总黄酮后，可明显改善上述指标并呈剂量依赖性。