克癀胶囊改用人工麝香、人工牛黄前后对肝癌细胞的影响

纪翠芳 章明敏

肝癌是我国死亡率位居第二的恶性肿瘤［1］，其主要病因包括乙型肝炎、丙型肝炎、黄曲霉毒素、蓝藻毒素、吸烟、饮酒、肥胖、糖尿病和代谢综合征等［2］。肝癌具有起病隐匿，病程短，预后差等特点［3］，给国人健康和社会经济带来沉重的负担。传统中医理论认为，恶性肿瘤的发生是在脏腑阴阳气血失调、正气虚弱的基础上，外邪入侵，痰湿、气瘀、毒等搏结日久，渐积而成［4］。克癀胶囊是中医传统肝病治疗用药，主要由三七、牛黄、麝香、蛇胆等十七味中药组成，主要用于湿、热、瘀、毒所致各种疾病，临床上对肝癌患者具有一定效果。克癀胶囊在2005年以前所使用的麝香为天然麝香，在2004年以前使用的牛黄为天然牛黄。后来受国家政策因素，改为人工牛黄和人工麝香。本研究为考察配方更改前后药效学的变化情况，分别设置KHJC-1、KHJC-2、KHJC-3三组。各组除牛黄与麝香不同外，其他组分及配方均相同。试验分别考察三组克癀胶囊对人源肝癌细胞Huh7的影响。

1 材料与方法

1.1 药物及试剂 供试药：克癀胶囊(深圳同安医药有限公司，批号：KHJC-1：171001、180101；KHJC-2：171002、180102；KHJC-3：171003、180103)。空白对照组：培养基90%DMEM+10%FBS(即完全培养基)。阴性对照组：含1%二甲基亚砜(DMSO)的完全培养基。受试药组：配制KHJC-1、KHJC-2、KHJC-3分别为浓度640、320、160、80、40、20、10、5 mg/L的含药培养基。DMEM培养基(gibco公司)。胎牛血清(FBS)(浙江天杭生物科技股份有限公司)。DMSO(MP Biomedicals，LLC)。胰酶(吉诺生物医药技术有限公司)。青链霉素溶液(吉诺生物医药技术有限公司)。

1.2 仪器 超净工作台(苏州安泰空气技术有限公司，型号：SW-CJ-2FD)。酶标仪(Biotek，型号：ELX-808IU)。电子天平(日本/岛津，型号：TW423L)。台式低速离心机(湖南湘仪实验室仪器开发有限公司，型号：TDZ5-WS)。倒置显微镜(广州粤显光学仪器，型号：XDS-3)。高压蒸汽灭菌锅(上海博迅实业有限公司，型号：YXQ-LS-50G)。电热恒温水槽(上海一恒科学仪器有限公司，型号：DK-8D)。CO2培养箱［上海一恒科学仪器有限公司，型号：BPN-150CH(UV)］。

1.3 实验细胞 人肝癌Huh7细胞：细胞代号：Huh7；来源：中国科学院细胞库；培养条件：37℃、5%CO2；培养基：90%DMEM+10%FBS。特定突变位点：端粒酶逆转录酶(TERT)。用MTT比色法检测受试药克癀胶囊对癌细胞的增殖抑制作用。

1.4 细胞复苏 配戴防冻手套，从液氮罐中取出冻存管，检测冻存管密封状态，投入37℃恒温水槽中轻轻摇动。1.0～1.5 min后，待溶液解冻后，转移至15 ml离心管中 1000 r/min离心5 min。弃掉上清液，加入了1 ml的培养基反复吹打使细胞处于分散悬浮状态。按1∶3比例将细胞悬液接种于新培养瓶中，补足培养基至5 ml，轻轻摇匀。

1.5 细胞培养 肿瘤细胞株(HepG2；Huh7)培养在含有10% FBS、青-链霉素的对应细胞完全培养基中(pH 7.2～7.4)，置于含5% CO2的37℃恒温培养箱中培养24 h后，更换培养基。选择对数生长期细胞，用于实验。

1.6 试验操作 本试验供试品用不同溶媒进行溶解，溶剂选择：无机溶剂：完全培养基、生理盐水；有机溶剂：乙醇、甲醇、乙酸乙酯、丙酮、DMSO。最终DMSO溶解度最佳，故选择DMSO作为阴性对照品。

取对数生长期细胞进行铺板，调整细胞浓度，以每孔5×104个接种于96孔板中，每孔体积200 μl。边缘孔不加细胞，加入同等体积的无菌磷酸缓冲盐溶液(PBS)。将96孔板放入5% CO2，37℃条件下孵育24 h。

弃掉旧培养基，按照配制方法分组加入含药培养基培养(药物最终暴露浓度为640、320、160、80、40、20、10、5 μg/ml)，每孔体积200 μl，药物浓度即为终浓度。每个剂量设8个复孔，于5% CO2、37℃孵育24～72 h，倒置显微镜下观察药物的作用效果。

发现各组细胞形态发生变化后，每孔加入20 μl MTT溶液(5 mg/ml，即0.5%MTT)，继续培养4 h。孵育4 h后，终止培养，小心吸去孔内含MTT培养基。每孔加入150 μl DMSO，振荡10 min，以确保结晶完全溶解。

使用酶标仪于490 nm波长处测吸光度，以测得吸光度值(OD)。按下列公式计算细胞生长的抑制率：细胞生长抑制率=(1-给药组OD值/对照组OD值)×100%。并按中效方程计算抑制浓度(IC50)值。

1.7 观察指标 统计不同浓度KHJC-1、KHJC-2、KHJC-3含药培养基对Huh-7细胞增殖的抑制作用，使用倒置显微镜观察各组细胞形态及数量的变化，判断结束暴露时间，并记录给药后图像数据。

1.8 统计学方法 采用SPSS17.0统计学软件处理数据。计量资料以均数±标准差()表示，采用t检验；P＜0.05表示差异有统计学意义。KHJC-1、KHJC-2、KHJC-3对Huh7细胞增殖抑制试验的MTT结果未见边缘效应干扰，使用每个浓度重复孔数为n=8进行结果统计。

2 结果

2.1 倒置显微镜下细胞形态观察 KHJC-1、KHJC-2、KHJC-3各浓度暴露24 h后，Huh7细胞肿瘤细胞株随暴露浓度上升细胞变圆，萎缩凋亡，细胞数量明显减少，肉眼可见较明显的量效关系。细胞形态见图1，图2，图3。

2.2 不同浓度KHJC-1、KHJC-2、KHJC-3含药培养基对Huh-7细胞增殖的抑制作用统计 不同浓度KHJC-1、KHJC-2、KHJC-3对Huh7细胞增殖均有抑制作用，见表1。

图1 MTT试验中，Huh7细胞在KHJC-1(剂量组最终浓度分别为640、320、160、80、40、20、10、5 μg/ml)、1%DMSO溶剂和完全培养基作用24 h后细胞形态图

图2 MTT试验中，Huh7细胞在KHJC-2(剂量组最终浓度分别为640、320、160、80、40、20、10、5 μg/ml)、1%DMSO溶剂和完全培养基作用24 h后细胞形态图

图3 MTT试验中，Huh7细胞在KHJC-3(剂量组最终浓度分别为640、320、160、80、40、20、10、5 μg/ml)、1%DMSO溶剂和完全培养基作用24 h后细胞形态图

表1 不同浓度KHJC-1、KHJC-2、KHJC-3含药培养基对对Huh7细胞增殖抑制作用(，n=8)

表1 不同浓度KHJC-1、KHJC-2、KHJC-3含药培养基对对Huh7细胞增殖抑制作用(，n=8)

2.3 结果分析 对于Huh7细胞，KHJC-1、KHJC-2、KHJC-3在5-640 μg/ml的浓度范围内，最高抑制率分别为57.20%、42.32%、56.85%；在作用24 h后的IC50分别为366.72 μg/ml、1762.00 μg/ml、330.78 μg/ml，各剂量组间呈量效关系，对Huh7肝癌细胞增殖的抑制效果强弱顺序为：KHJC-3＞ KHJC-1＞KHJC-2。

3 讨论

试验结果显示，克癀胶囊的KHJC-1、KHJC-2、KHJC-3三个配方组对Huh7肝癌细胞均有增殖抑制作用，各剂量组间呈量效关系。克癀胶囊对Huh7人源肝癌细胞的抑制效果强弱顺序为：KHJC-3＞ KHJC-1＞KHJC-2。表明含人工牛黄与人工麝香的克癀胶囊(KHJC-3)比其他含天然牛黄、天然麝香(KHJC-1)或天然牛黄、人工麝香的克癀胶囊(KHJC-2)具有更好的抗人源肝癌细胞Huh7效果。

人工牛黄由牛胆粉、胆酸、猪去氧胆酸、牛磺酸、胆红素、胆固醇、微量元素等加工制成［5］，是我国传统名贵动物药材牛黄的代用品，具有清热解毒，化痰定惊的功效。人工牛黄在临床得到广泛应用，缓解了牛黄供应长期紧张的问题［6］。人工麝香属国家保密配方，其疗效及安全性与天然麝香近似，临床疗效确切［7］，药效学试验证实两者抗炎作用相当，可以完全替代天然麝香［8］。本试验结果充分证明，在改变配方后，克癀胶囊在抗Huh7人源肝癌细胞方面具有更好的效果。从药物经济学角度上看，克癀胶囊KHJC-3配方组更具有优势。这对于缓解天然牛黄、天然麝香资源紧张状况具有一定的帮助，同时也能够降低企业成本，降低患者用药负担，节约国家医保经费。对于促进中医药长远、可持续发展也具有一定的积极作用。

克癀胶囊由人工牛黄、人工麝香、蛇胆汁、三七、黄芩、黄连、黄柏、大黄等药材组成。其中三七所含成分三七皂苷(PNS)具有增强免疫的功能，能够抑制肿瘤细胞增殖，逆转化疗耐药等作用［9］。黄芩中含有多种黄酮类化合物，包括黄芩素、黄芩苷等，主要通过抑制端粒酶活性、阻滞细胞周期、诱导肿瘤细胞凋亡等达到抗肿瘤目的［10］。黄连中所含黄连素能对肺癌、肝癌、卵巢癌等多种癌症具有活性，主要通过抑制肿瘤细胞增殖、诱导细胞凋亡等达到抗肿瘤作用［11］。黄柏中主要成分小檗碱具有良好的抗胃癌、宫颈癌活性［12］。大黄中有效成分大黄素具有抑制肝癌细胞生长，在联合多种抗肿瘤药物时，能够起到增强疗效降低副反应的作用［13-15］。克癀胶囊各组分具有抗肿瘤的协同作用，其抗肿瘤作用可能为中药复方多成分多靶点协同增效的机理，但其明确的抗肿瘤机制尚需更进一步的研究。

综上所述，克癀胶囊的KHJC-1、KHJC-2、KHJC-3三个配方对Huh7肝癌细胞有增殖抑制作用，各剂量组间呈量效关系，对Huh7肝癌细胞的抑制效果强弱顺序为：KHJC-3＞ KHJC-1＞ KHJC-2。