基于双氨基粘土絮凝的嗜热微藻采收实验研究

2020-07-23张海若陈鹏宇梁园梅MaurycyDaroch

可再生能源 2020年7期

张海若，陈鹏宇，梁园梅， Maurycy Daroch

（北京大学深圳研究生院环境与能源学院，广东深圳 518055）

0 引言

微藻是地球上重要的初级生产者，具有个体微小、种类繁多、光合效率高、生长速度快、生长周期短等优点，并能够将光能和二氧化碳转化为多种高附加值产品，如藻蓝蛋白、不饱和脂肪酸、类胡萝卜素等[1]，[2]。微藻可以在生活及工业废水中生长并有效去除废水中的重金属离子。随着化石燃料的日益枯竭，利用微藻生产生物柴油是国内外研究者普遍关注的重要技术之一[3]。

虽然微藻有十分广阔的应用前景，但是，微藻的分离、采收一直是一个基础性技术难题，严重限制了微藻的产业化发展。微藻细胞个体小（2～40 μm）、易破裂，且带负电的微藻细胞悬浮于培养液中，微藻的采收成本占整个微藻生产（包括采收和养殖）总成本的20%～30%，甚至更高。因此，寻找一种低成本、高效率的采收方法成为微藻开发应用的关键。收获微藻的传统方法包括过滤、离心、絮凝、浮选、超声和电解法等[4]，[5]。然而，对于大规模收获微藻而言，这些方法都存在一定的缺点，如过滤法易堵塞滤膜、浮选和离心方法能耗较高、超声和电解法能耗高且效率低。絮凝采收微藻是通过电中和、架桥及网捕作用，使分散的带电荷藻细胞聚集，从而实现固液分离，具有成本低、操作简便的特点，成为当下研究的热点[5]。

氨基有机硅酸盐（简称氨基粘土）由金属盐和有机三烷氧基硅烷在室温下合成，属于有机-无机纳米杂化材料，其作为絮凝剂逐渐引起人们的关注[6]。Lee Y C[7]将镁氨基酸盐（MgAC）用于收获含油的小球藻属，在30 min 内，小球藻属的收获效率可达100%。Farooq W[8]使用单一的镁或铁氨基酸盐（MgAC 或FeAC ）在短时间内收获了大量微藻。 Ji H M[9]将不同粒径的[MgAC]和[CeAC]的混合物用于收获浓度极低的蓝藻，在1 h 内，蓝藻的收获效率为100%。然而，对于平台期质量浓度较高的藻种来说，并没有相关的研究，因此，探究双氨基酸粘土能否高效采收质量浓度较高的藻种，并降低其工艺成本，将有利于藻种的开发与应用。

本研究将双氨基粘土（[MgAC]和[CeAC]的混合物）作为絮凝剂，通过观察采收效果，进一步研究了[MgAC]和[CeAC]的配用比例和絮凝时间对采收效果的影响，最终确定了絮凝剂的最佳配用比例和絮凝时间，为嗜热微藻采收提供了理论依据和方法支持。

1 材料与方法

1.1 实验材料

1.1.1 藻种和培养基

嗜热蓝藻PKUAC-E542 （富含藻蓝蛋白）由北京大学环境与能源学院生物质能源实验室采集、分离并保存，藻细胞大小为4～15 μm[10]。藻种培养所用的培养基为BG11 液体培养基。

1.1.2 仪器设备

Epoch 微孔板分光光度计（BioTech 公司）、Olympus BX53 显微镜（OLYMPUS 公司）、高速离心机（Eppendorf 公司）、Milli-Q 去离子净水机（Millipore 公司）、PB－10 标准型pH 计（Sartorius公司）、BSA124S-CM 分析电子天平（Sartorius 公司）、电热鼓风干燥箱（上海一恒科学仪器有限公司）、BX-2F 恒温磁力搅拌器（常州普天仪器制造有限公司）、PS-80AL 超声清洗仪（深圳市超艺达科技有限公司）等。

1.1.3 主要试剂

3-氨基丙基三乙氧基硅烷（APTES，分析纯）、氯化镁六水合物（MgCl2·6H2O，分析纯）、氯化铈七水合物（CeCl3·7H2O，分析纯）、氯化铁六水合物（FeCl3·6H2O，分析纯）、乙醇（C2H5OH，分析纯）、蒸馏去离子水（Millipore）。

1.2 实验方法

1.2.1 培养方法

图1 为室外光生物反应器。

图1 室外光生物反应器Fig.1 Outdoor photobioreactor

将2 L 藻种于发酵罐（直径为12 cm，高度为50 cm）中培养7 d，培养过程中通入空气并持续搅拌，使用自然光源，培养温度为45 ℃。待嗜热蓝藻生长至指数生长中期进行扩培，将藻种接种至容积为50 L 的光生物反应器（直径为25 cm，高度为100 cm）中曝气培养，通入气体为空气，反应器置于室外。培养过程中仍采用自然光源，每日中午12：00 测量记录其吸光度（OD），并记录每日温度及辐射量。培养8 d，绘制生长曲线并收集藻液用于微藻絮凝实验。

1.2.2 微藻质量浓度和细胞密度与吸光度的关系测定

取适量藻液，用干重法建立嗜热蓝藻的质量浓度和吸光度的对应关系，结果如图2 所示。从图2 可以看出，嗜热蓝藻的质量浓度与吸光度有较高的拟合关系，在一定浓度范围内可用吸光度（OD685nm）代替微藻的质量浓度[11]。从图2 还可以看出，嗜热蓝藻的细胞密度（细胞数目）也与吸光度具有较好的拟合关系。

图2 标准浓度曲线Fig.2 Standard concentration curve

1.2.3 双氨基粘土絮凝剂的制备

分别称取8.4 g MgCl2-6H2O 和CeCl3-7H2O溶解在200 mL 乙醇溶液中，磁力搅拌10 min 后，滴加约13 mL 的APTES，使APTES 中Si 与Mg/Ce的比例达到1∶1.34，然后磁力搅拌溶液12 h，得到白色浆状的MgAC 和黄色浆状的CeAC；将两种浆料以3 000 r/min 的转速离心15 min，再用100 mL 乙醇溶液洗涤两次，在设定温度为60 ℃的烘箱中干燥24 h；干燥后，可获得砾石状的MgAC 和CeAC；将MgAC 和CeAC 研磨成粉末，分别称取1 g MgAC 和CeAC 粉末于100 mL 锥形瓶中，加入100 mL 去离子水，再通过超声浴处理10 min，得到分散均匀的浓度为10 mg/mL 的MgAC 和CeAC 悬浮液。

将MgAC 和CeAC 悬浮液在超声浴中以不同比例（1∶0，1∶1，1∶2，1∶5，1∶8，0∶1，2∶1，5∶1 和8∶1）混合至均匀，得到9 种不同混合比例的双氨基粘土絮凝剂（[ACs]混合物）。

1.2.4 絮凝试验

取不同混合比例的[ACs]混合物各1 mL，分别加入装有9 mL 嗜热蓝藻藻液的离心管中，将藻液与[ACs]混合物混合至均匀，每种比例设置3 组平行样品，空白对照组中加入1 mL 去离子水。采用分光光度计法，在不同的时间间隔（0，20，40，60，90，120 min）距离样品溶液顶部的5 cm 处取样，测量其在685 nm 处的OD，并根据式（1）计算絮凝效率。

式中：R 为絮凝效率，%；ODO为初始藻液的吸光度；ODf为絮凝后上清液的吸光度。

1.2.5 细胞密度对絮凝效率的影响

已知本研究中的嗜热蓝藻的细胞密度与OD之间具有线性关系，设置5 组不同的OD685nm（2.5，2，1.5，1，0.5），每组设3 个平行样品，选择絮凝效果最佳的一种[ACs]混合物配比，将该配比的[ACs]混合物分别加入样品藻液中，测量0，20，40，60，90，120 min 内各样品的OD685nm，并计算絮凝效率，从而探究嗜热蓝藻的细胞密度对絮凝效果的影响。

1.2.6 藻液pH 值对絮凝体系的影响

有研究表明，在微藻培养过程中，由于微藻自身合成的糖苷或多糖等絮凝活性物质分泌到细胞表面，与周围的藻细胞相互作用会引发细胞自絮凝现象[12]。在微藻培养过程中，藻液pH值等因素的变化会对藻细胞的自絮凝现象产生影响，即一些藻种在藻液pH 值较高的条件下会发生自絮凝现象，为排除[ACs]混合物自身pH值对实验的影响，测量不同混合比例的[ACs]混合物及藻液的初始pH，并在加入[ACs]混合物沉降20 min 后测量此时藻液的pH 值，分析藻液pH 值的变化是否会对藻细胞的絮凝效果产生影响。

1.2.7 显微镜观察

分别取各实验组藻液絮凝2 h 后的底部絮凝层，制作临时标本，利用显微镜观察絮凝后藻细胞的絮凝状态及生理活性。

2 结果与分析

2.1 双氨基粘土体系的絮凝效率

加入[ACs]混合物20 min 时，各实验组的絮凝效果如图3 所示。从图3 可以看出：各实验组的絮凝效果差别较大，当[MgAC]和[CeAC]的配用比例分别为1∶1，1∶2，2∶1，5∶1 和8∶1 时，大部分微藻已经沉淀在离心管底部，上清液颜色较为透明，絮凝效果均较好；当[MgAC]和[CeAC]的配用比例为1∶0 和1∶5 时，部分微藻沉淀在离心管底部，上清液较为浑浊，即仍有大量微藻悬浮于培养液中，絮凝效果一般；当[MgAC]和[CeAC]的配用比例为0∶1 和1∶8 时，絮凝效果较差，离心管底部未见明显的微藻沉降，与空白对照组相比，并无太大差异。

图3 各实验组的絮凝效果Fig.3 Flocculation effect of each experimental group

将2 h 内微藻动力学收获结果绘制成图4。从图4 可以看出，在20 min 内，各实验组的絮凝效率均逐渐增大，最大可达75%，最小仅为5%，当絮凝时间超过20 min 后，各实验组的絮凝效率基本保持不变。

图4 絮凝效率随[ACs]配比的变化Fig.4 Variation of flocculation efficiency over [ACs] ratio

与空白对照组相比，加入[ACs]混合物的实验组的絮凝效率均有不同程度的增加。这是因为氨基粘土中的质子化胺基团起到带正电荷的纳米团簇作用，可与带有负电荷的微藻细胞进行桥接，通过静电作用使微藻细胞聚集沉降下来。同时，加入不同比例[ACs]混合物的实验组的絮凝效果有很大差别。有研究表明，两种不同尺寸的[ACs]在各自的水溶液中具有10～1 000 nm 的粒度分布[9]。不同的[ACs]混合比例使之形成紧密程度不同的网状结构。从图4 还可以看出：当[MgAC]和[CeAC]的比例为0∶1 时，微藻的絮凝效率仅为5%左右，与空白对照组基本一致；当仅有[MgAC]存在时，微藻的絮凝效率提高至18%，这可能是因为[MgAC]的二维结构为网状，且具有较高的分层程度和较小的尺寸（直径约为30 nm）；当[MgAC]和[CeAC]的比例为1∶8 和1∶5 时，[CeAC] 所占比例均较大，微藻的絮凝效率仍在30%以下；当 [MgAC]和[CeAC]的比例为1∶1 时，微藻的絮凝效率突然增至60%；当[MgAC]和[CeAC]的比例分别为8∶1，5∶1，2∶1 和1∶2 时，微藻的絮凝效果最佳，絮凝效率可达70%以上，表明在这4 种比例下，[ACs]混合物可形成紧密的网状结构，通过强大的网捕作用使微藻细胞团聚沉降。

2.2 细胞密度对絮凝效率的影响

由上文可知，当[MgAC]与[CeAC]的配比为2∶1时，微藻的絮凝效果最佳，将该配比的[ACs]混合物加入到5 组不同细胞密度的藻液中，各组2 h内的絮凝效率如图5 所示。

图5 絮凝效率随藻种细胞密度的变化Fig.5 Variation of flocculation efficiency over cell density

从图5 可以看出，藻液的OD685nm越低（藻液细胞密度越低），微藻的絮凝效果就越好；随着藻液OD685nm的逐渐增大（藻液细胞密度的增大），微藻的絮凝效率会大大降低。文献[9]的研究结果也表明，双氨基粘土絮凝剂对浓度极低（0.05～0.2 mg/mL）的微藻具有很好的收集效果。在本研究中，嗜热蓝藻在平台期的OD685nm一般为1.0～1.5，因此，本实验选取的藻液初始OD685nm为1.5（对应的藻液质量浓度约为12.31 mg/mL）。从图5 可以看出，对于OD685nm为1.5 的嗜热蓝藻来说，双氨基粘土絮凝剂仍然具有较好的絮凝效果，且此时的藻液浓度处于该种嗜热蓝藻平台期的浓度范围，更符合实际生产。但是，当嗜热蓝藻的浓度过高时，双氨基粘土絮凝剂的絮凝效率会大大降低，因此，微藻采收时应注意对藻种浓度的控制。

2.3 藻液pH 值对絮凝实验的影响分析

不同比例的[ACs]混合物及加入[ACs]混合物后的藻液pH 值如表1 所示。由表1 可以看出，加入[ACs]混合物后，藻液的pH 值为9.83～9.95，而藻液的初始pH 值为9.98，由此可见，[ACs]混合物的添加基本不会影响絮凝体系的pH 值，说明絮凝现象并非由体系pH 值的改变所导致，而是基于双氨基粘土絮凝剂（[ACs]混合物）的絮凝作用。

表1 絮凝剂初始pH 值及絮凝后藻液的pH 值Table 1 Initial pH value of flocculant and pH value of algae solution after flocculation

2.4 显微镜观察

显微镜观察到的絮凝后微藻细胞的絮凝状态如图6 所示。从图6 可以看出：加入[ACs]混合物的实验组的微藻细胞根据絮凝程度聚集成不同大小的团状，当[MgAC]与[CeAC]的比例为1∶2，2∶1，5∶1 和8∶1 时，微藻的絮凝效率较高，在显微镜下呈现较好的团聚状态，100倍镜头下可以看到明显的聚集带；空白对照组的微藻细胞分布均匀，排列整齐，未见有明显的藻细胞团聚状态。其他实验组有不同程度的聚集，但范围和规模较小，藻细胞的排列较为松散。

图6 絮凝后的蓝藻在放大倍数为40，100，1 000 倍下的形态Fig.6 The flocculated cyanobacteria form at 40， 100 and 1 000 times magnification

2.5 安全及应用性分析

关于[ACs]混合物的安全性，主要考虑是否会影响藻细胞的生理活性。Han H K[13]的实验结果表明，[MgAC]在所有测试的细胞中几乎没有细胞毒性，即使[MgAC]的浓度高达1 000 μg/mL，仍不会对细胞活力和细胞膜产生影响。 [CeAC]在低浓度下表现出很少的斑马鱼胚胎毒性[9]。在显微镜观察过程中，可以看到各实验组的微藻细胞仍能进行细胞分裂，并有小范围的细胞活动，藻细胞仍具有生理活性，可进一步应用于后续脂质提取等开发利用。 Farooq W[14]在研究中将[MgAC]作为添加剂加入微藻培养基中，研究结果表明，[MgAC]可以增加藻细胞的大小和脂质含量。 Lee Y C[15]使用[MgAC]收获含油小球藻，发现[MgAC]还可作为脂质提取剂，其阳离子氨基可提高脂质提取和生物柴油转化效率。综上可知，[ACs]基本不会对藻细胞的生理活性及后续开发利用产生影响，并可作为添加剂与藻细胞共存，促进藻细胞的生长。