PDIA3对人Jurkat T细胞TCR信号通路的调控

周云，刘海龙，靳照宇

(1.河北大学 生命科学学院，河北 保定 071002；2.北京蛋白质组研究中心 北京 102206 )

T细胞是免疫系统的重要组成部分，在细菌、病毒等病原体的免疫应答，抵抗癌症、感染以及自身免疫性疾病方面起着至关重要的作用[1-2].T细胞通过识别由抗原呈递细胞捕获的外源多肽段, 从而激活T 细胞及下游的一系列免疫反应.活化的T细胞可以诱导包括ζ-链相关蛋白70(zeta-chain associated protein 70, ZAP70)磷酸化、细胞因子分泌、转录因子NF-κB(nuclear factor kappa-B)、NFAT(nuclear factor of activated T-cells)激活等一系列生物学过程[3].

TCR(T cell receptor)是T细胞表面的标志性受体，它与分化抗原簇3(cluster of differentiation 3, CD3)分子结合，形成TCR-CD3复合物.TCR通路在T细胞激活过程中具有重要作用，特异性的抗体识别TCR后，会激活TCR通路下游的一系列蛋白，调节T细胞的分化和活化等.

通过本实验室前期的工作，在TCR复合物中发现了调控T细胞受体信号通路的有效分子PDIA3，该分子是蛋白质二硫键异构酶A3前体(protein disulfide isomerase A3 precursor, PDIA3)，属于二硫键异构酶家族[4].PDIA3是一种巯基-氧化还原酶伴侣蛋白[4]，分子质量为58 ku，是信号转导和转录激活因子3信号通路中的一部分[5]，在多种细胞，尤其是免疫细胞中表达水平较高，参与细胞信号转导、主要组织相容性复合物组装[6-7]、血小板功能[8]、转录[9]、骨发育[10]及凋亡诱导等多种重要的生物学过程.有研究表明，PDIA3在卵巢癌、乳腺癌、子宫癌、肺癌和胃癌等多种癌组织中都有表达[4]. 到目前为止，几乎没有相关研究表明PDIA3表达与TCR信号传导途径之间的关系.由于PDIA3在免疫细胞中高表达，所以笔者提出假说：PDIA3作为重要的免疫调控靶点，在TCR下游通路的级联反应发挥重要作用.

本文旨在研究PDIA3对Jurkat T细胞中TCR下游通路的调控作用.利用电穿孔法将PDIA3基因的siRNA成功导入Jurkat T细胞中并成功敲低了PDIA3蛋白表达，发现敲低了PDIA3蛋白能够下调ZAP70蛋白的磷酸化水平，抑制NF-κB信号通路，下调繁殖标记物CD69的表达以及IL-2的分泌，为今后深入研究PDIA3与TCR信号通路下游相关功能蛋白的相互作用提供了重要基础.

1 材料与方法

1.1 实验材料

1.1.1 细胞

Jurkat T和Jurkat-NF-κB T细胞株保存于本实验室.

1.1.2 干涉序列

PDIA3基因的siRNA-794(5'-GGACAAGACUGUGGCAUAUTT-3')以及siRNA-NC(negative control siRNA, siNC)由苏州吉玛基因合成.

1.1.3 试剂材料

胎牛血清(fetal bovine serum,FBS)(Gibco USA)；1640培养基(Gibco USA);放射免疫沉淀法缓冲液(radioimmunoprecipitation assay buffer, RIPA)；电转缓冲液(HyClone EPB1)；电转杯OC-100(MaxCyte OC-100 processing assembly)；一抗：Y319 Rabbit mAb 抗体(CST, 2701S)、PDIA3 Rabbit mAb抗体(proteintech, 15967-I-AP)、ZAP70 Rabbit mAb抗体(CST, 27054S)、甘油醛-3-磷酸脱氢酶(glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase, GAPDH) mouse mAb抗体(北京傲锐生物科技有限公司，TA-08)；二抗：山羊抗兔IgG/辣根过氧化物酶标记(中杉金桥，ZB-2301)；山羊抗小鼠IgG/辣根过氧化物酶标记(中杉金桥，ZB-2305)；CD69抗体(invitrogen, 12-0699-42)；ONE-Glo荧光素酶报告基因检测系统(Promega, E606B)；The BD OptEIATMReagent Set B(BD, 55-534)；BD OptEIATMHuman IL-2 酶联免疫吸附测定(enzymelinked immunosorbentassay,ELISA) Set(BD, 555190).

1.2 实验方法

1.2.1 细胞培养

用含有体积分数10% FBS的1640培养基,体积分数 5% CO2, 37 ℃条件下恒温培养；细胞生长至培养瓶70%开始下一步转染实验.

1.2.2 细胞转染

收取约2×107T细胞，磷酸盐缓冲溶液(phosphate buffer saline, PBS)清洗1遍，用50 μL电转缓冲液重悬细胞.将细胞悬液与15 μL siRNA(20 μmol/L)混匀，加到电转杯OC-100中，根据电转仪操作手册进行电转.结束后，立即取出细胞，移至T25细胞培养瓶中，并吹成液滴状，放入培养箱中孵育，得到2组干涉后的细胞分别是Jurkat-siNC T和Jurkat-si794 T.孵育40 min后向细胞培养瓶中加入10 mL培养基，并放入培养箱中继续培养48 h，用于后续的功能实验.

1.2.3 Western blotting检测

设置CD3抗体质量浓度梯度分别为10、100、200 ng/mL 3组，每组中加1 μg/mL的CD28抗体协同刺激细胞，得到3组CD3/CD28抗体混合溶液(还有1组不加抗体刺激).收取Jurkat-siNC T细胞和Jurkat-si794 T细胞，用抗体混合溶液于37 ℃刺激细胞20 min.

取抗体刺激的细胞(～2×106)加入RIPA并超声破碎提取蛋白，取12 μg蛋白经体积分数10% SDS-PAGE电泳，在Bio-Rad电转移系统中将凝胶蛋白带转移到聚偏二氟乙烯膜上，50 g/L脱脂牛奶室温封闭1 h，利用兔抗人pZAP70(Y319)、ZAP70、PDIA3抗体和鼠抗人GAPDH抗体分别作为一抗，4 ℃过夜孵育，TBST洗3次膜，每次10 min，辣根过氧化物酶标记的羊抗兔IgG、羊抗鼠IgG分别作为二抗室温孵育90 min，TBST洗3次，Western blotting分析T细胞中目的蛋白表达情况.

1.2.4 流式细胞术检测CD69的表达

设置CD3抗体质量浓度分别为10、200、500、1 000 ng/mL，均加1 μg/mL的CD28抗体协同刺激细胞.将Jurkat-siNC T细胞和Jurkat-si794 T细胞用CD3/CD28抗体刺激12 h后，再用藻红蛋白标记的CD69抗体和isotype来识别CD69分子，4 ℃冰箱避光放置30 min，最后通过流式细胞仪检测CD3/CD28抗体激活的T细胞中CD69的表达情况.

1.2.5 ELISA试剂盒检测IL-2分泌情况

本实验设置1个实验孔和2个副孔，重复3次.用100 μL CD3抗体(5 μg/mL)提前包被96孔板，4 ℃过夜.将包被的96孔板用PBS洗3次.收取Jurkat-siNC T细胞和Jurkat-si794 T细胞，用CD28抗体稀释液(1 μg/mL)重悬细胞，以每孔约2×105的细胞密度接种到96孔板中.CD3/CD28抗体刺激24 h后，收取上清液，通过ELISA试剂盒检测细胞上清液中IL-2的分泌情况.

1.2.6 Luciferase assays检测NF-κB信号通路

本实验设置1个实验孔及2个副孔，重复3次.设置CD3抗体质量浓度分别为1、3、5 μg/mL，均加1 μg/mL的CD28抗体协同刺激细胞.将Jurkat-NF-κB-siNC T细胞和Jurkat-NF-κB-si794 T细胞以每孔约2×105的细胞密度接种到96孔板中，用CD3/CD28抗体刺激6 h后，通过ONE-Glo荧光素酶报告基因检测系统检测细胞中的荧光信号强度.

1.2.7 数据分析

NC.siNC; 794. si794.下同. 图1 PDIA3调节CD3/CD28抗体激活的ZAP70 蛋白的磷酸化水平Fig.1 PDIA3 regulates the phosphorylation of ZAP70 protein by CD3/CD28 antibodies

使用GraphPad Prism 5进行数据统计分析及柱形图的绘制.组间比较采用双尾Student’s t-检验，当P<0.05时，组间差异显著.

2 结果

2.1 敲低PDIA3抑制ZAP70蛋白磷酸化

ZAP70 是一种细胞质蛋白酪氨酸激酶，属于 Syk 蛋白家族.ZAP70 主要在 T 细胞和自然杀伤细胞中表达，是 T 细胞受体活化所必需的蛋白.为了检测PDIA3蛋白是否对ZAP70蛋白的磷酸化修饰有影响，进行了siRNA细胞电转染实验，电转后48 h，用不同质量浓度的CD3/CD28抗体协同刺激细胞.通过前期预实验发现，当CD3抗体质量浓度大于200 ng/mL时，ZAP70蛋白的磷酸化修饰水平(pZAP70(Y319))在实验组和对照组中几乎无差别.猜测可能是CD3质量浓度过高，导致T细胞活化效率太高.适当降低CD3抗体的工作质量浓度，分别用10、100、200 ng/mL CD3抗体和CD28抗体激活20 min,结果如图1所示.由图1可知，成功敲低了PDIA3的蛋白表达，而且不同质量浓度的CD3抗体刺激对ZAP70蛋白表达没有影响.在CD3和CD28抗体的刺激下，对照组pZAP70(Y319)蛋白表达水平明显提高，并且与CD3抗体的质量浓度呈现正相关，表明在抗体刺激下，ZAP70蛋白的磷酸化水平提高，但是在敲低了PDIA3蛋白之后，ZAP70的磷酸化水平几乎没有变化. 所以敲低了PDIA3蛋白会抑制ZAP70蛋白磷酸化，从而会影响T细胞活化.

2.2 敲低PDIA3抑制CD69的表达

CD69是T细胞活化后最早表达的表面抗原，是T细胞活化的早期标志物，通常在抗体刺激1～2 h后即可在T细胞表面发现CD69分子.为了探究PDIA3是否会对CD69的表达产生影响，用CD3/CD28抗体刺激细胞，由于前期实验发现当CD3抗体质量浓度大于1 μg/mL时，超出仪器检测范围，所以适当降低CD3抗体的工作质量浓度.设置了不同质量浓度的CD3(10， 200， 500， 1 000 ng/mL)加CD28(1 μg/mL)抗体协同刺激Jurkat-siNC T细胞和Jurkat-si794 T细胞，刺激 12 h后，加入CD69染色抗体来识别并标记细胞膜上的CD69，通过流式细胞术检测T细胞膜上的CD69的表达情况，结果如图2所示.由图2可知，当CD3抗体质量浓度为0也就是T细胞没有被激活的状态下，Jurkat-si794 T细胞与Jurkat-siNC T细胞的CD69表达量无显著性差异(P>0.05)，加入CD3/CD28抗体刺激T细胞后，2组细胞的CD69表达量升高，同时Jurkat-si794 T细胞组的CD69表达量显著低于Jurkat-siNC T细胞组(P<0.05)，表明在敲低了PDIA3蛋白会影响CD69的表达.当CD3抗体质量浓度为200 ng/mL时，2组的CD69表达量差异最大.所以在T细胞未活化情况下，PDIA3对CD69的表达没有影响，当T细胞活化后CD69表达显著升高，而敲低PDIA3会对T细胞活化通路上CD69的表达产生抑制作用.

图2 PDIA3对CD3/CD28抗体激活的Jurkat T 细胞CD69表达的调控Fig.2 PDIA3 regulates the expression of CD69 by CD3/CD28 antibodies in Jurkat T cells

2.3 敲低PDIA3抑制IL-2的表达

IL-2是一种T细胞生长因子，通过TCR信号通路可以调控IL-2的基因表达，属于TCR信号通路活化下游的一个分子，能促进T淋巴细胞增殖和分化，同时能诱导和增强B细胞、单核巨噬细胞、自然杀伤细胞的活力等，在调控T细胞免疫应答中发挥着重要作用.因此，将Jurkat-siNC T细胞和Jurkat-si794 T细胞用CD3(5 μg/mL)加CD28(1 μg/mL)抗体刺激24 h后，收集细胞培养上清液，通过ELISA试剂盒检测培养基中的IL-2分泌情况，结果如图3所示.由图3可知，敲低PDIA3可显著抑制IL-2的表达(P<0.01)，所以敲低PDIA3后可能对T细胞的生长分化产生影响.

图3 PDIA3对CD3/CD28抗体激活的 Jurkat T细胞中IL-2分泌的调控Fig.3 PDIA3 regulates the secretion of IL-2 by CD3/CD28 antibodies in Jurkat T cells

2.4 敲低PDIA3对NF-κB信号通路的作用

NF-κB是一种重要的、普遍存在的转录因子，主要参与免疫调节及炎症反应，淋巴细胞发育，细胞增殖、分化、凋亡，肿瘤形成等.如果NF-κB信号通路调控失衡，会导致多种人类疾病，如慢性炎症、肿瘤和原发性免疫缺陷病等.为了探究PDIA3是否参与调控NF-κB信号通路，用CD3/CD28抗体刺激细胞，实验发现当CD3抗体质量浓度小于1 μg/mL时，抗体对于细胞NF-κB信号通路的激活作用并不明显.于是适当提高CD3抗体的工作质量浓度，分别用1、3、5 μg/mL CD3抗体和CD28抗体刺激细胞，通过荧光素酶报告基因检测系统检测细胞中的荧光信号强度，结果如图4所示.由图4可知，当不加入抗体刺激时，siNC组与si794组的荧光活性较弱且荧光强度无显著性差异(P>0.05)，加入CD3/CD28抗体激活后，实验组和对照组荧光强度显著增强，不同质量浓度梯度的CD3抗体刺激细胞，均可以激活NF-κB信号通路，但是敲低了PDIA3后，其荧光强度相比较于NC组具有显著性差异(P<0.01)，所以敲低PDIA3能够抑制NF-κB信号通路.

图4 PDIA3对CD3/CD28抗体激活NF-κB信号通路的调控Fig.4 PDIA3 regulates the NF-κB signaling by CD3/CD28 antibodies

3 讨论

PDIA3是PDI家族的成员，主要定位于内质网.一些早期报道发现，PDIA3在肿瘤发生、细胞增殖、细胞凋亡、肿瘤转移、血管生成及化学抗性中发挥着重要作用[11].有研究表明，早期宫颈癌预后不良与PDIA3的下调有关[12].但是，在乳腺癌发生过程中，发现PDIA3表达上调[13].然而PDIA3在免疫组织中的功能研究尚不清楚.

在本研究中，利用电转干涉在Jurkat T细胞中成功敲低PDIA3蛋白表达.通过CD3/CD28抗体刺激活化T细胞，增强ZAP70蛋白的磷酸化修饰水平，结果表明,敲低PDIA3蛋白会减弱ZAP70蛋白的磷酸化修饰水平，表明PDIA3与T细胞的活化相关，为了进一步验证PDIA3与T细胞的活化相关，用CD3/CD28抗体刺激T细胞，并检测早期活化标志物CD69的表达情况.结果表明，在T细胞未活化状态下，CD69的表达量比较低，且敲低PDIA3对于CD69的表达量没有影响.当T细胞受到抗体刺激活化后，CD69的表达量显著升高，敲低PDIA3会抑制CD69的表达.ZAP70蛋白磷酸化水平的变化和CD69表达量变化表明 PDIA3蛋白参与了T细胞活化过程.T细胞的免疫应答往往还与下游IL-2细胞因子的分泌以及远端NF-κB信号通路相关，所以本文进一步研究了PDIA3与IL-2细胞因子及NF-κB信号通路之间的关系，发现敲低PDIA3会显著下调IL-2的分泌.在Luciferase assays实验中，活化的T细胞会激活NF-κB信号通路，而敲低PDIA3能够抑制NF-κB信号通路，表明PDIA3蛋白会参与调控T细胞免疫应答的下游通路.

本研究结果显示，在T细胞中敲低PDIA3可以抑制ZAP70蛋白的磷酸化修饰、 CD69分子表达、IL-2分泌及NF-κB信号通路.因此，猜想PDIA3可能与下游的T细胞活化连接蛋白、含有SH2的白细胞蛋白76 kDa和磷脂酶C-γ1等分子的磷酸化修饰有关.但是PDIA3对T细胞受体信号通路的具体调控机制以及对下游转录因子的影响是比较复杂的，需进一步对其机制做深入研究.未来本课题组准备进行磷酸化功能实验研究，检测PDIA3分子对TCR信号通路下游的上述分子是否存在调控作用，并构建PDIA3过表达质粒，进行功能回补实验的验证.本研究结果为今后对PDIA3与TCR下游一些功能蛋白的相互作用和分子机制研究提供重要基础.