运动、Nrf2与骨骼肌线粒体

王林佳 于晶晶 张缨

1 北京体育大学运动人体科学学院（北京 100084）

2 北京体育大学中国运动与健康学院（北京 100084）

核因子E2 相关因子2 （nuclear factor erythroid 2-related factor 2，Nrf2）是一种广泛存在于哺乳动物细胞内的转录因子[1]，正常生理条件下，Nrf2 是与细胞质中的 Kelch 样 ECH 相关蛋白 1（Kelch-like ECH-as⁃sociated protein 1，Keap1）蛋白相互结合的。被结合的Nrf2 无法从细胞质移位进入细胞核，阻止了Nrf2 在核内识别并结合靶基因中特异的DNA 启动子序列－－抗氧化反应元件（antioxidant response element，ARE），从而抑制了Nrf2 对下游的过氧化氢酶（（catalase，CAT）、超氧化物歧化酶（superoxide dismutase，SOD）和血红素加氧酶（heme oxygenase，HO）-1 等一系列抗氧化酶基因转录的启动[2-4]（图1）。Nrf2-ARE 所调控的抗氧化信号转导通路被认为是细胞抗氧化防御系统的核心部分[5]。然而，近些年来越来越多的证据表明Nrf2-ARE还对线粒体生物发生及呼吸功能相关基因的表达发挥着重要的调控作用[6-8]。

图1 Nrf2-ARE转录调控作用[2-4]

研究发现，通过对比衰老的（20～24 月龄）Nrf2 敲除（KO）与野生型（WT）鼠发现，老年Nrf2 KO鼠的运动能力和肌肉质量下降，骨骼肌线粒体形态受损，线粒体含量（线粒体DNA 拷贝数）减少，以及调节线粒体功能的相关蛋白——核呼吸因子1（NRF1）、线粒体转录因子（mTFA）、过氧化物酶体增值物激活受体γ共激活因子（PGC-1α）、线粒体融合蛋白1（Mfn1）、线粒体动力相关蛋白1（Drp1）等的表达水平降低[9]。以上结果表明，Nrf2对线粒体数量、结构和功能均具有一定的调节作用。

1 运动对Nrf2表达和Nrf2-ARE结合活性的影响

运动影响Nrf2表达或活性已在许多研究中得到证实。Horie 等对C2C12 细胞采用电脉冲刺激（EPS）以模拟急性运动，结果表明EPS 可诱导C2C12 细胞中Nrf2蛋白表达增加，且增加幅度与刺激强度和持续时间有关[10]。Muthusamy 等研究发现，急性运动（60min/天，共2 天）导致WT 鼠心肌组织中Nrf2 核积累和Nrf2-ARE结合活性显著增加，而在Nrf2 KO 鼠中未观察到这些变化[11]。在人体试验中，受试者进行持续90 分钟的急性运动后，股外侧肌中Nrf2 mRNA 表达显著增加[12]。雄性 ICR/CD-1 小鼠经过不同时间（45、90、120 或 150 min）的运动后，小鼠腓肠肌和股四头肌中Nrf2 表达及下游抗氧化酶SOD、GSH（glutathione）表达增加[13]。此外，长期运动训练对Nrf2 也有一定的影响。有研究报道，8 周有氧运动后，WT 鼠骨骼肌中 Nrf2 mRNA 表达显著增加，但Nrf2 蛋白表达未出现显著变化[14]。另有文献表明，6 周跑台训练后WT 鼠骨骼肌Nrf2 转录活性提高，细胞色素C氧化酶（cytochromec oxidase，COX）活性增加可达到20%，但这种运动训练产生的积极适应在Nrf2 KO鼠的骨骼肌中并未出现[15]。以上表明，急性运动或长期运动训练均可能影响Nrf2 表达和/或Nrf2-ARE结合活性。

2 运动激活Nrf2调控骨骼肌线粒体

目前，Nrf2 对线粒体内结构和功能的调节已经得到证实，而运动在此过程中发挥的作用也越来越多地引起人们的关注。运动激活Nrf2可能通过促进线粒体生物发生、改善线粒体呼吸功能和调节线粒体自噬等多个方面对骨骼肌线粒体发挥调节作用。

2.1 运动激活NNrrff2促进骨骼肌线粒体生物发生

线粒体生物发生是线粒体自我更新和损伤修复的机制之一，与线粒体功能及能量代谢密切相关。骨骼肌收缩[16]、低温刺激[17]、热量限制[18]等应激因素均能影响线粒体生物发生。

线粒体生物发生和功能运作是由一组相关的核转录因子和调控因子网所控制。核呼吸因子（nuclear re⁃spiratory factors，NRFs）包括 NRF1 和 NRF2，是一类由核基因编码的能调控线粒体呼吸链亚基表达的转录因子。研究发现在NRF1 启动子中包含多个AREs，Nrf2可与之结合并促进NRF1 的表达[19]。进而，NRFs 在调控核基因和线粒体基因编码的呼吸链亚基表达中发挥直接或间接的作用[20]。例如，线粒体复合体Ⅱ（Com⁃plex Ⅱ）中的琥珀酸脱氢酶（succinate dehydrogenase，SDH），由 SDHa、SDHb、SDHc、SDHd 构成。其中在SDHa 和SDHd 基因的启动子上发现有NRF1 的结合位点[21]。COX 是线粒体电子传递链的末端组分。由13个亚基组成，在10个核编码的COX亚基的DNA启动子上都有NRF1 的功能性结合位点[22]。NRF1 也可以通过结合靶基因mTFA 的启动子，介导mTFA 调节线粒体DNA（mtDNA）的转录与复制。研究证实，人类mTFA 基因的启动子活性高度依赖于NRF1 和NRF2 的识别和结合位点，并且NRF1与mTFA启动子结合起决定作用[23]。

PGC-1α是转录共激活因子，可与转录因子协同作用以增加对其靶基因转录[24;20;25;26]。PGC-1α的表达水平直接影响骨骼肌线粒体增值效率[27]。研究表明，PGC-1α过表达小鼠与WT 鼠相比，骨骼肌内mTFA 蛋白表达显著性增加[28]。PGC-1α通过与NRF1 转录因子结合，增加对靶基因mTFA 的转录活性，提高mTFA 的mRNA水平[29]。已有细胞和动物实验表明，采用Nrf2激活剂SFN 孵育人成纤维细胞可导致PGC-1α 和1β mRNA 表达 增 加[30]，也可 导 致 Keap1-knockdown 小 鼠（Nrf2活性高）肝脏PGC-1α mRNA 表达显著升高[31]，表明Nrf2 激活可促进PGC-1α表达（图2）。但目前仍缺乏采用Nrf2 敲除小鼠验证Nrf2 可影响骨骼肌中PGC-1α表达的直接证据。

线粒体的含量和密度是评价线粒体生物发生的重要指标[32]。与WT鼠相比，Nrf2KO小鼠肝脏线粒体含量较低，若24 小时禁食可进一步降低这一水平。而Ke⁃ap1-knockdown 小鼠，虽然与WT 鼠相比其肝脏线粒体含量没有显著差异，但24 小时禁食并不影响其线粒体含量[33]。Nrf2 激活剂SFN 提高人成纤维细胞中线粒体含量[30]，也可提高3T3-L1脂肪细胞线粒体的含量，促进线粒体生物发生[34]。

有氧运动训练造成骨骼肌适应的主要表征之一是线粒体含量和密度增加[35]。已有文献报道，7 周的有氧训练可显著增加人体骨骼肌线粒体体积和密度[36]，8 周有氧运动后，大鼠腓肠肌 mtDNA（Atp6）/核 DNA（Tert）比值显著增加[37]。通过Nrf2KO 和WT 小鼠进行一次力竭性运动发现，WT 鼠骨骼肌Nrf2 的mRNA 和蛋白、以及线粒体生物发生标志物——NRF1和mTFA 的mRNA表达显著性增加；而Nrf2 KO 鼠由于Nrf2 的缺失，阻止了运动诱导的骨骼肌NRF1 和mTFA mRNA 表达增强[38]。另外，采用 3 月龄 WT 和 Nrf2 KO 鼠进行 6 周跑台运动，也发现此运动训练可激活WT鼠骨骼肌Nrf2转录活性，增加线粒体ComplexⅠ和mTFA 蛋白表达，而同龄的Nrf2 KO 鼠骨骼肌并未出现这些变化[15]。以上表明Nrf2可能在有氧运动促进骨骼肌线粒体的生物发生和增加线粒体含量的过程中发挥着重要的作用（图2）。

图2 有氧运动介导Nrf2促进骨骼肌线粒体生物发生

2.2 运动激活NNrrff2改善骨骼肌线粒体呼吸功能

线粒体呼吸作用是供能物质在线粒体内经过一系列的氧化分解（主要包括三羧酸循环及氧化磷酸化），最终生成二氧化碳和水，并产生ATP 的过程。线粒体膜电位是线粒体进行呼吸作用的基础[39;40]。

Nrf2 影响线粒体呼吸、氧化磷酸化效率和膜电位[7]。采用不同的细胞实验发现：在人结肠癌细胞中通过shRNA 沉默Nrf2 后，ATP 水平和耗氧量显著低于未沉默组[8]。正常神经元细胞中加入寡霉素（氧化磷酸化抑制剂）导致ATP 水平显著下降，但加入碘乙酸（糖酵解抑制剂）却没有这样的效果。而在沉默Nrf2 的神经元细胞中，加入寡霉素并未造成ATP 水平下降，加入碘乙酸则ATP 水平降低。这表明正常神经元细胞中ATP 主要依赖于氧化磷酸化产生，而糖酵解和非氧化磷酸化是Nrf2 缺乏的神经元细胞产生ATP 的主要通路[7]。另外，采用测定新鲜活体线粒体在ADP 存在（Ⅲ态呼吸）与否（Ⅳ态呼吸）的情况下溶解氧的消耗差异，即呼吸控制率（RCR），以评价线粒体结构和功能完整性以及氧化磷酸化效率，结果显示Nrf2 缺失小鼠脑和肝脏中线粒体RCR降低[7]。

运动训练提高运动能力可能与运动激活Nrf2提高骨骼肌线粒体呼吸和氧化磷酸化效率有关。已有研究报道注射6-羟基多巴胺（6-OHDA）可造成C57BL/6 小鼠偏侧震颤麻痹。偏侧震颤麻痹小鼠骨骼肌Nrf2 表达、ComplexⅠ和柠檬酸合成酶（CS）活性下降，而6 周跑台运动可显著激活骨骼肌Nrf2，改善线粒体呼吸功能，并提高偏侧震颤麻痹鼠的运动能力[41]。另有研究发现，10 周龄大鼠采用70%VO2max 强度运动训练14周后，其骨骼肌Nrf2、ComplexⅣ和COXⅣ蛋白表达以及CS 活性均出现显著性增加[35]。进一步通过Nrf2 KO鼠和WT 小鼠研究发现，5 周运动训练显著提高WT 鼠骨骼肌CS 活性及运动能力，Nrf2 KO 鼠与WT 鼠相比，运动能力和全身能量消耗降低[38]。

2.3 运动激活NNrrff2可能调节骨骼肌线粒体自噬

线粒体自噬是指细胞通过自噬的机制选择性地清除功能失调或衰老的线粒体的过程[42]，对整个线粒体功能完整性和细胞生存至关重要[43]。

Nrf2 可能通过调节线粒体自噬而在线粒体质量控制中起重要作用[2]。研究发现，诱导线粒体自噬的一个小分子化合物－－P62 介导的线粒体自噬诱导物（P62-mediated mitophagy inducer，PMI），是最初被用作Nrf2 的激活剂，它可解离Nrf2 与Keap1 的相互作用。在正常细胞中加入PMI 后，可定位观察到线粒体中自噬体标志物－－微管结合蛋白轻链3（microtu⁃bule associated protein 1 light chain 3，LC3）增加，Nrf2沉默细胞中则未观察到此变化[44]。也有研究发现，在感染金黄色葡萄球菌造成的小鼠败血症模型中，感染24 小时后小鼠肺组织线粒体LC3-Ⅱ蛋白表达显著增加，而Nrf2 KO 鼠没有出现LC3-Ⅱ表达的变化[45]。对高脂饲养24周的Nrf2 KO小鼠肝脏切片的超微结构分析显示，其线粒体存在肿胀，并伴随着嵴排列减少和膜破坏；但WT 鼠未出现这些变化[46]。以上结果表明Nrf2 对线粒体自噬具有调节作用。运动可促进骨骼肌Nrf2表达及其转录活性[47]，因此我们推测运动激活Nrf2可进一步调节骨骼肌线粒体自噬，尽管目前尚缺乏进一步证据。

3 小结

运动与骨骼肌线粒体的结构和功能密切相关，Nrf2 在骨骼肌线粒体生物发生、线粒体呼吸作用及线粒体自噬等方面发挥着重要作用。运动可能通过促进骨骼肌Nrf2表达和转录活性、提高线粒体数量、增加线粒体功能、维持线粒体稳态，从而对运动能力的增强具有积极作用。长期适当的体育锻炼可激活骨骼肌内一系列的信号通路，提高其代谢适应。作为信号通路之一，Nrf2-ARE 对骨骼肌线粒体结构和功能调控的分子机制仍有待于进一步深入研究。