耐热白桦茎叶高效再生体系的建立

黄晓旭

（河北农业大学园林与旅游学院，河北 保定071001）

白桦（Betula platyphylla）为桦树科、桦树属落叶乔木。高海拔树种，是荒山荒地、采伐迹地和火烧迹地的先锋树种，是温带阔叶林和阔叶混交林的主要树种，具有耐寒性强、适应性好、生长速度快等优点，姿态潇洒、树干通直、树皮洁白雅致、枝叶扶疏，秋叶金黄，引人注目[1-2]。耐热白桦（Heat-resistant Betula platyphylla）是白桦的一个耐热型品种，由东北林业大学利用欧洲白桦和黑龙江白桦杂交而得，通过由北京市园林科研所、北京七彩园林工程有限公司等单位引种证明，耐热白桦可以在北京生长良好[3]。近几十年来，桦木属植物的组织培养研究取得了较大的进展，关于白桦、光皮桦、欧洲白桦、欧洲垂枝桦、西南桦等的植株再生研究相继得到报道[4]。例如，东北林业大学在1998年就开展白桦组织培养再生体系的研究；Leena 等人对垂枝桦（Betula pendula）组织低温保存后的再生植株与原植物的遗传保真度进行了比较[5]；Lu-Min VAARIO 等人开展日本桦树组培体系的研究[6]；黑龙江省林产工业研究所于2018年展开了沼泽小叶桦（Betula microphylla Bunge var.paludosa）的研究[7]。但国内关于耐热型白桦组织培养快繁育苗的研究尚未见报道。本研究中利用植物组织培养的方法进行耐热白桦苗木快速繁殖的研究，获得了完整的再生植株，并实现了再生植株的移栽，对于推动耐热白桦在华北地区的应用，具有重要意义。

1 材料与方法

1.1 试验材料

研究材料为河北省林业和草原科学研究院栽植的耐热白桦3年生苗木，引种于山东。

1.2 试验方法

1.2.1 外植体选择

外植体选取生长正常、无病虫害的耐热白桦幼叶和茎段。

1.2.1 外植体消毒

先用75%的酒精，分别浸泡20s、30s、40s，以无菌水冲洗2～3 次；再用2%次氯酸钠溶液分别浸泡8min、9min、10min，最后用无菌水冲洗3～5 次。培养后随时统计污染情况，培养20 d 统计存活率。

1.2.2 分化培养

采用MS、和WPM 作为基本分化培养基，分别加入不同浓度的6-BA 和IBA。培养条件：温度24 ℃，室内相对湿度30%，每天16 h（6：00－22：00）光照培养。接种后观察愈伤组织增殖和生长状况，培养第25 d 统计分化芽数。具体培养基见表1。

表1 耐热白桦分化培养基类型和激素配比

1.2.3 生根培养

采用1/2MS、MS 和WPM 作为基本分化培养基，分别加入不同浓度的IBA，接种后观察生根情况，培养第20d 统计生根条数。具体培养基见表2。

表2 耐热白桦生根培养基类型和激素浓度

1.3 数据统计分析

试验结果的基础数据用统计汇总后，利用统计分析软件对试验数据进行多重比较分析、方差等分析。

2 试验结果与分析

2.1 外植体最佳消毒方法

由表3 可见，酒精处理时间对组培苗褐化的影响较大，其中，浸泡20s、30s 的褐化率没有显著差异，处理40s，叶子褐化率显著增大；次氯酸钠处理时间，则对组培苗长菌率影响较大，浸泡8min、9min 的处理结果没有显著差异，浸泡10min 的叶子生菌率大大降低。因此，最佳耐热白桦的外植体消毒以浸泡75%酒精溶液中30s，无菌水冲洗2～3 次，再用2%次氯酸钠溶液浸泡10min，最后用无菌水冲洗3～5 次为宜。

表3 外植体消毒处理结果

2.2 分化培养基筛选

表4 分化培养基筛选结果

叶片分化效率最高的培养基为：wpm+0.5 mg/L 6-BA+0.1 mg/L IBA，分化效率达94%（表4），叶片5 天开始膨大形成愈伤组织，25 天左右分化出丛生芽；茎段最佳分化培养基为：MS+1 mg/L 6-BA+0.1 mg/L IBA，分化效率达92%，7 天开始膨大形成愈伤组织，25 天左右分化出丛生芽。

2.3 生根培养基筛选

再生芽长至1cm 左右时接种至生根培养基培养。耐热白桦初代生根选用1/2ms+0.2 mg/L IBA 培养基最好，接种后5 d 开始生根，生根率96.7%，继代生根用wpm+0.3 mg/L IBA 培养基最好，接种后7 d开始生根，生根率100%。

表5 生根培养基筛选结果

3 结论与讨论

在植物器官离体组织培养的条件下，不同植物组织对营养要求不同，甚至同一植物不同部位的组织对营养的要求也不同[5]。培养基是植物组织培养的物质基础，也是植物组织培养能否获得成功的重要因素之一[6]。本研究从外植体消毒、分化培养基的筛选、生根培养基的筛选三个方面，试验总结出耐热白桦最优组织培养步骤，即：外植体浸泡于75%酒精溶液中30s，以无菌水冲洗2～3 次，再用2%次氯酸钠溶液浸泡10min，最后用无菌水冲洗3～5 次；叶片分化培养基选择WPM+0.5 mg/L 6-BA+0.1 mg/L IBA，茎段分化培养基选择MS+1 mg/L 6-BA+0.1 mg/L IBA；生根培养基最佳选择为：初代生根用1/2MS+0.2 mg/L IBA 培养基最好，继代生根用WPM+0.3 mg/L IBA 培养基。

组织培养过程中会发生基因大片段丢失的情况，这也是创制新种质的方法。在本次试验中，耐热白桦的组培苗出现了花叶、白化叶突变体，因涨势较弱未能成功转化为白桦新品系，但此突变材料可作为直接研究色素代谢，光合作用以及激素合成等通路分子机理的重要植物材料。项目组下一步工作重点将以此为出发点，着重开展利用组织培养创制白桦新种质的工作。