夏季层叠式蛋鸡舍乳头式饮水工艺细菌含量检测

2020-07-21盛环宇马瑞钰杨荣斌

中国农业大学学报 2020年7期

万意盛环宇马瑞钰杜强杨荣斌詹凯*

(1.安徽省农业科学院畜牧兽医研究所/畜禽产品安全工程安徽省重点实验室，合肥 230001；2.安徽农业大学动物科技学院，合肥 230001；3.安徽圣迪乐村生态食品有限公司，安徽铜陵 244100)

随着蛋鸡产业的迅速发展，鸡舍内部的环境卫生质量逐渐受到养殖企业的重视[1-2]。持续不断的清洁饮用水和干燥的采食环境对鸡群胃肠道系统健康和日常生产性能至关重要[3-5]。乳头式密闭式饮水系统是目前国内规模化蛋鸡场普遍采用的饮水装置，可以有效地封闭水源，提高水质洁净度[6-7]。在生产过程中，大部分养殖场为了防止水线乳头故障漏水和鸡群饮水外洒滴落粪便传送带，导致传送带上粪便含水率增加，通常在饮水线水管的下方对应安装一条V型接水槽，将洒漏出的水盛接起来汇集流向舍外[8-9]。由于V型槽长期暴露于空气环境中，生物气溶胶中致病菌落[10]及水线水中夹杂的金属沉淀物和各种药物等会滴落至槽中聚集[11]，在适宜温度下造成微生物迅速繁殖，时间久了还会形成一些粘稠的沉淀污物附着于槽壁上。通过对笼内鸡群活动的观察发现，蛋鸡在采食后喜欢啄饮V型槽中的水和堆积物，这可能会对鸡群的生长健康和生产性能有着严重影响。

本研究拟以8层层叠式密闭笼养蛋鸡舍为研究对象，在夏季高温天气对舍内不同笼层饮水装置中细菌微生物进行检测，比较水线水和V型槽水的污染情况及其对蛋鸡产蛋性能和蛋品质的影响，以期为蛋鸡舍内环境控制和乳头式饮水系统的完善提供指导依据。

1 材料与方法

1.1 试验鸡舍概况

本试验于2019年06-04—08-13，在安徽圣迪乐村生态食品有限公司的8层层叠式笼养密闭鸡舍内进行。鸡舍分为上下各4层，中间为钢网管理走道，单栋存栏罗曼粉壳商品蛋鸡5 万只；鸡舍呈南北走向，长73.0 m，宽16.0 m，高6.3 m，4列5走道，单列单层笼位数量为135个；舍内安装纵向湿帘通风系统，湿帘位于鸡舍净道端山墙及两侧，面积138 m2；风机位于污道端山墙上，分3层排列，每层6台；采用行车喂料、乳头饮水器饮水、传送带清粪、自动集蛋系统的生产工艺。试验鸡日粮营养水平参照《罗曼粉壳商品蛋鸡饲养管理手册》执行。

1.2 试验动物与分组

在蛋鸡371日龄时，选择鸡舍内东边相邻2列的前端(靠近湿帘端，第13号笼)、中端(第73号笼)、后端(靠近风机端，第133号)，每端选测1、3、5、7层，共计24个监测点(图1(a)(b))，试验期内若有鸡只死亡，则选用体重相近的鸡只代替。

1.3 水线水和V型槽水采集

每2周1次，测定各监测点对应鸡笼内水线内水和V型槽内水(图1(c))细菌总拷贝数，同时记录各点的温度和湿度。水线水用无菌离心管直接接取50 mL；V型槽中积水用2 mL胶头滴管吸取，V型槽内无水时使用灭菌棉拭子刮取，一同加入离心管后加DEPC水稀释至50 mL。所有采样材料均提前1天高压灭菌。

1.4 细菌总数测定

1.4.1引物设计

Real-Time PCR(QPCR)引物使用诺禾致源16S rDNA微生物测序引物扩增16S V4～V5区域，引物序列为515-F：5′-GTG CCA GCM GCC GCG GTA A-3′；907-R：5′-CCG TCA ATT CCT TTG AGT TT-3′，扩增片段长度为412 bp。

图1 采样检测点示意图Fig.1 Diagram of the monitor points

1.4.2样本总DNA提取

离心管中50 mL样本过滤于0.22 μm 滤膜后，用1 mL灭菌水洗脱；拭子用灭菌水涡旋洗涤，使得细菌充分溶解于1 mL水中；样本DNA采用磁珠法DNA提取试剂盒提取(MagBead DNA Purification Kit，CW2508)，使用微量核酸检测仪器测定浓度(杭州奥盛Nano-100，超微量核酸蛋白定量仪)，用于检测后数据计算。

1.4.3标准品质粒制备

标准品以大肠杆菌16S rDNA为参照物，根据细菌16S rDNA通用引物(515-F/907-R)扩增位置，将大肠杆菌16S rDNA第515～926位共412 bp的序列插入克隆载体pUC57中(本试验标准品质粒采用基因合成的形式获得)，重组标准品质粒命名为pUC57-16S rDNA。pUC57-16S rDNA全长3122 bp，抽提质粒浓度为142.93 ng/μL，计算其拷贝数为4.17×1010拷贝数/μL。用ddH2O将标准品稀释至拷贝数为4.17×109～4.17×103拷贝数/μL，共计7个浓度梯度，用于标准曲线建立。

1.4.4QPCR反应体系及步骤

采用SYBR Green I法实时荧光定量PCR(绝对定量)进行样本细菌总拷贝数检测；定量PCR试剂盒为TransStart Green qPCR SuperMix(北京全式金，AQ131)。20 μLQPCR反应体系如下：2×PCR Mix10 μL，上游引物0.5 μL，下游引物0.5 μL，RNaseFree ddH2O 7 μL，模板2 μL。反应条件：94 ℃预变性30 s；循环程序为94 ℃变性5 s，61 ℃退火延伸50 s，共40个循环。熔解曲线法的反应条件如下：97 ℃ 1 s，65 ℃ 60 s，95 ℃ 1 s；其中 65～95 ℃区间为熔解曲线生成区间。

1.5 产蛋性能测定

在各监测点选择3个相邻笼位为1组，每笼饲养6只鸡，每组共18只鸡。试验过程中，每天上午记录各组蛋鸡的产蛋率、鸡蛋质量和畸形蛋率。每2周1次，收集各组蛋鸡所产鸡蛋，测定蛋品质性状：鸡蛋质量、蛋壳强度、蛋壳厚度、蛋壳颜色、蛋黄颜色、蛋白高度和哈氏单位。蛋壳颜色用蛋壳颜色测定仪(QCR 型)测定，使用前采用黑白2块标准瓷块校正，黑色瓷块的校正值为0，白色瓷块的校正值为79.9，分别测定蛋壳钝端、中间和锐端3个点的蛋壳颜色，最后取平均值；蛋壳厚度用蛋壳厚度测定仪(GSA-1020型)测定；蛋壳强度用蛋壳强度测定仪(EGG-0503型)测定；鸡蛋质量、蛋白高度、蛋黄颜色和哈氏单位用多功能蛋品质分析仪(EMT-5200型)测定。

1.6 数据处理

试验数据采用SPSS 22.0软件进行单因素方差分析，使用Turkey法进行多重比较，试验结果以“平均数±标准差”表示，以P<0.01作为差异显著性判断。每1 mL样本水中细菌总拷贝数以10为底取对数表示。

2 结果与分析

2.1 不同笼层的温、湿度

夏季不同时间测定第1、3、5、7层温度和湿度见表1。不同时间点所测定温、湿度存在明显差异，由平均值来看，舍内平均温度从第1层(29.33 ℃)至第7层(30.26 ℃)逐渐升高，平均相对湿度呈降低趋势。

表1 夏季鸡舍内不同笼层温度和湿度Table 1 The temperature and humidity on different tiers in layer house during summer

2.2 不同笼层水线水和V型槽水中细菌总拷贝数

夏季不同时间测定第1、3、5、7层水线水和V型槽水中细菌总数见表2。各笼层水线水中细菌总拷贝数在各阶段差异不大，第5、7层平均值比第1、3层约高0.16个单位(1.45倍)。各笼层V型槽水细菌总拷贝数各阶段差异不大(P>0.01)，其中第1层平均值最高为9.77个单位，第7层值最低为9.70个单位。比较水线水和V型槽水细菌总拷贝数，发现各阶段V型槽水中细菌总拷贝数均远高于水线水中(P<0.01)，高达46.77至 1 905.46 倍。

2.3 不同笼层蛋鸡生产性能和蛋品质

舍内不同笼层蛋鸡产蛋率、畸形蛋率及蛋品质比较分别见表3、4。各笼层产蛋率存在显著差异(P<0.01)，第7层最高为81.08%，第1层最低为77.61%，第3层和第7层均高于第1层和第5层。各笼层畸形蛋率无显著差异(P>0.01)。从蛋品质性状看，第1层鸡蛋质量最大，蛋黄颜色最深，蛋壳强度最小；第7层鸡蛋质量最小，蛋壳强度最大；蛋壳颜色最深，蛋黄颜色最浅；第7层蛋白高度和哈氏单位均显著高于其他各层(P<0.01)；各笼层蛋壳厚度均无显著差异(P>0.01)。

2.4 细菌拷贝数与产蛋率和蛋品质的相关性分析

水线水和V型槽水细菌数与产蛋性能的相关性分析见表5。水线水和V型槽水中细菌总拷贝数在各笼层均呈弱正相关，相关系数r=0.046～0.183。水线水中细菌总拷贝数与产蛋率均呈弱相关；与鸡蛋质量除了在第7层呈弱负相关，在其他层均呈弱正相关；与蛋白高度和哈氏单位在第3、5层呈正相关，在第1、7层呈弱负相关。V型槽水中细菌总拷贝数与产蛋率和鸡蛋质量除了在第1层呈弱正相关，在其余各笼层均呈负相关；与蛋白高度和哈氏单位在各笼层均呈不同程度弱负相关(r=-0.037～-0.192)。

表3 鸡舍内不同笼层产蛋率和畸形蛋率Table 3 The laying rate and abnormal egg rate of layers ondifferent tiers in layer house

3 讨论与结论

鸡群采食和饮水是有害微生物进入体内的主要途径[12]，随着密闭式乳头饮水器的普及，水线水的生物安全防治逐渐得到生产者的重视[13]，但是V型接水槽的卫生情况容易被忽视。饮水器漏出的水和鸡采食的残渣滴漏至V型槽中，加上长期暴露于空气中从而促使细菌滋生严重，还可能会产生有害气体[14]。利用16S rDNA 细菌通用引物扩增，通过实时荧光定量PCR法检测细菌含量已被广泛的应用于畜禽健康及其制品的卫生安全[15-17]。本试验应用实时定量PCR 的方法成功检测了水线水和V型槽水中细菌含量，发现在夏季各阶段所测V型槽水中细菌总拷贝数量在各笼层均远远高于水线水中，最高可达1 905倍。水线水中细菌含量远低于V型槽中，这是因为生产过程中会对鸡群饮用水提前进行消毒处理，同时舍内水线水也会定期冲洗，然而从未清洗处理过V型槽内积水和堆积的内容物，因此槽内细菌微生物随着时间繁殖滋生，污染程度远高于水线水中。

韩海霞等[18]发现在5层层叠式笼养蛋鸡舍内，上层产蛋率高于下层；卢元鹏等[19]通过比较不同4层层叠式鸡舍不同笼层蛋鸡产蛋性能，发现第1层产蛋率最低，第3层产蛋率最高。本试验中，8层层叠式蛋鸡舍内第3、7层产蛋率高于第1、5层，鸡蛋质量小于第1、5层，剔除鸡只本身的原因，这可能还与各笼层间温度、湿度、通风量等环境差异有关[19-20]；第1、5层V型槽中细菌总拷贝数高于第3、7层，因此推测蛋鸡产蛋率可能与V型槽内微生物环境有关，槽内污物等有机物中含有大量的病原微生物，如不及时清理和消毒，会使致病菌滋生易引起禽病发生，从而降低生产性能[21]；同样发现第7层蛋鸡蛋白高度和哈氏单位均显著高于其余各层，这可能与第7层V型槽中细菌总拷贝数最低有关，推测V型槽内环境水平可能对蛋鸡输卵管健康有一定影响。

商品蛋鸡场环境卫生监测是蛋鸡养殖技术体系的重要部分，养殖场在完善禽病防控的过程中，禽舍内部环境的消毒和病原微生物控制至关重要[22-23]。本试验中，水线水和V型槽水中细菌总拷贝数在不同笼层均呈正相关，因为当鸡啄饮乳头时会造成饮水器漏水或外洒至V型槽内[8]，所以水线中微生物滋生也会增加V型槽中的细菌数量。水线水中细菌总拷贝数与产蛋率、鸡蛋质量、蛋白高度和哈氏单位在各笼层均呈不同程度的正、负弱相关，且无规律性，未呈现出对生产性能和蛋品质有影响趋势；V型槽水中细菌数与产蛋率和鸡蛋质量在第3、5、7层均呈弱负相关，与蛋白高度和哈氏单位在各笼层均呈不同程度弱负相关，表明V型槽内细菌微生物污染有致使蛋鸡生产性能和鸡蛋品质下降的趋势，舍内鸡群若长期啄饮V型槽内水可能会影响机体健康。因此，鸡场在做好舍内饮水线安全卫生控制的同时，还需要提高对V型水槽内污染情况的关注。