内生拮抗细菌X1-6-1的鉴定、发酵条件优化及抑菌作用研究

蒋晶晶，王春明，陈明，周昭旭，杜蕙

(1.甘肃省农业科学院植物保护研究所，甘肃 兰州 730070；2.农业部天水作物有害生物科学观测实验站，甘肃 天水 741000)

植物内生菌(Endophyte)普遍存在于植物体内，定殖传导，能经受住植物自身的防卫反应，对植物本身不造成明显可见病害及功能改变.主要包括内生真菌、内生细菌和内生放线菌[1-2].当前，植物内生菌的研究已经成为植物学、植物保护学、农药学等多个学科领域的研究热点，具有重要的研究和开发价值.

近年来利用葡萄内生菌防治葡萄病害的研究报道表明葡萄中存在能够抑制葡萄病原菌生长的拮抗菌群，这些菌群是开发葡萄病原物微生物生防制剂的重要菌种来源.崔欣等[3]从葡萄果穗上分离得到2株对葡萄灰霉病优势拮抗的芽孢杆菌；周泠璇等[4]从红提葡萄中分离出5株对葡萄灰霉病具有较好抑制效果的内生细菌；刘旭等[5]发现葡萄内生菌CS5对葡萄霜霉病具有很好的防效；于晓丽等[6]从葡萄叶片上分离获得的菌株YTB1452对葡萄白腐病菌和葡萄炭疽病菌均具有较好的拮抗作用.但是，目前从葡萄不同组织中发掘内生菌及利用微生物资源防治葡萄病害进行生物防治的研究仍比较少.

本研究从葡萄健康叶片中分离、纯化的大量菌株中，挑选了对葡萄灰霉病菌、葡萄炭疽病菌有较好抑制作用的植物内生细菌X1-6-1，初步测定其对另外6种重要农业病害病原菌抑制作用.通过形态学观察及基因分析初步明确菌株种属关系，并对发酵培养基和培养条件进行筛选优化，为后期将生防菌制作成菌肥，更好地应用到农业生产中奠定基础.

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 供试菌株 拮抗内生细菌X1-6-1：实验室保存，从葡萄健康叶片中分离获得.

供试植物病原菌共8种，分别是：1)油菜菌核病菌(Sclerotiniasclerotiorum)；2)葡萄灰霉病菌(Botrytiscinerea)；3)葡萄炭疽病菌(Colletortrichumgloeospriodes)；4)棉花炭疽病菌(ColletortrichumgossypiiSouthw)；5)西瓜蔓枯病菌(Didymellabryoniae)；6)马铃薯立枯病菌(Rhizoctoniasolani)；7)辣椒根腐病菌(Fusariumoxysporum)；8)大麦条纹病菌(Drechsleragraminea).均由甘肃省农业科学院植物保护研究所植物病理实验室提供.

1.1.2 供试培养基 PDA培养基、NA培养基、NA培养液(参照常规方法制备).

1.2 内生拮抗细菌X1-6-1的鉴定

1.2.1 形态学及生理生化特性研究 参考东秀珠等[7]《常见细菌系统鉴定手册》和方中达[8]《植病研究方法》的研究方法，进行形态特征观察、培养特性及生理生化特性测定.

1.2.2 16S rDNA鉴定 使用细菌基因组DNA提取试剂盒提取菌体DNA，通用引物27F/1492R进行PCR扩增，送上海生工生物科技有限公司进行测序.用BLAST软件将所得序列与GenBank数据库进行同源性比对分析，用DNAstar软件进行多序列比对，并用Neighbor-Joining 法构建系统发育树，确定该菌株的分类地位.

1.3 内生拮抗细菌X1-6-1抑菌活性及作用研究

采用平板对峙法，测定菌株对油菜菌核、葡萄灰霉等8种病原真菌菌丝生长的影响.取培养好的病原菌菌落边缘的菌丝块(d=5 mm)放在准备好的PDA平板中央，在培养皿背面距指示菌约2.5 cm处十字交叉法标记4点，分别在这4点接NA培养基上活化培养48 h的菌株，以不点接生防菌为对照，置于27 ℃下培养，待到对照病菌长满培养皿时，测量抑菌带的宽度(即生防菌菌落边缘到供试病原真菌菌落边缘的距离)并计算抑制率，重复3 次，取平均值.

菌落生长抑制率(%)=(对照菌落直径-处理菌落直径)/ 对照菌落直径×100

1.4 内生拮抗细菌X1-6-1发酵培养基成分及条件优化

1.4.1 种子液制备 将保存的X1-6-1菌株接入NA培养基平板上进行活化，28 ℃条件下培养24 h.再将活化的X1-6-1菌株接入NA液体培养液中，150 r/min，28 ℃条件下振荡培养48 h，备用.

1.4.2 菌悬液浓度计算 釆用稀释涂布平板法进行计算.即将培养好的X1-6-1菌株发酵液稀释至10-6、10-7、10-8g/mL 3个质量浓度梯度，分别吸取发酵液100 μL接入相应编号的培养皿中，用涂布棒涂抹均匀，每个稀释浓度3次重复，于28 ℃恒温培养箱中倒置培养2 d，记录平板内的单菌落数，并计算发酵液浓度.公式如下：发酵液浓度(cfu/mL)=平板中的平均单菌落数(cfu)×该发酵液的稀释倍数/平板上加菌量(mL)

采用分光光度计测定菌悬液的D值，以D600 nm值表示菌株生长量.D600 nm值在0.2～0.8比较准，不到该范围的应用初始培养液进行稀释，培养的实际的D值=所测D值×稀释倍数.

1.4.3 发酵培养基成分及条件优化 发酵基础培养基：牛肉膏3.5 g，蛋白胨5 g，酵母膏1.5 g，葡萄糖10 g，NaCl 5 g，水1 000 mL，pH 自然.

1.4.3.1 碳源的筛选 用葡萄糖、果糖、甘油、麦芽糖、甘露醇、蔗糖，可溶性淀粉等量替换发酵基础培养基中的碳源，用量为1%.

1.4.3.2 氮源的筛选 用牛肉膏、酵母膏、蛋白胨、氯化铵、硝酸铵、磷酸二氢铵、硝酸钾，尿素作为氮源分别等量代替发酵基础培养基中的氮源，用量为1%.

1.4.3.3 无机盐的筛选 用氯化钠、氯化镁、硫酸镁、硫酸钙、碳酸钙，磷酸氢二钾作为无机盐分别等量代替发酵基础培养基中的氯化钠，用量为0.5%.

向装有100 mL培养基的250 mL三角瓶中接入种子培养液1 mL，每个处理3次重复，28 ℃、150 r/min振荡培养2 d，测定各碳源、氮源、无机盐离子对X1-6-1菌株活菌量的影响.

1.4.4.4 发酵条件的优化 在发酵时间、温度、初始pH、转速，装液量分别为72 h、28 ℃、6.8、150 r/min，110 mL的基础条件下，保持其他因素不变，只改变其中一个因素，设置发酵时间为6、12、24、36、48、60、72、84、96 h；温度分别为20、25、28、30、35、40 ℃；初始pH分别为4.0、5.0、6.0、7.0、8.0、9.0；转速分别为60、90、120、150、180、210、240 r/min；装液量分别为30、50、70、90、110、130 mL mL，以菌体生长量为指标，每组试验重复3次进行单因素试验.

根据单因素试验结果，从中选择对内生拮抗菌X1-6-1菌体生长量影响较为显著的因素(发酵时间、温度和装液量)，使用DPS软件设计正交表，以OD600作为评价指标进行正交试验，从而确定最佳发酵条件.

1.5 数据处理

利用Excel 2003、DPS 3.01、SPSS 17.0软件对试验数据进行统计分析，所有数据均为3次重复的平均值.

2 结果与分析

2.1 菌株培养特性及生理生化特性

将菌株接种至PDA培养基，培养48 h后，内生拮抗细菌X1-6-1菌落呈乳白色不透明，表面粗糙有褶皱，边缘不规则(图1)，液体静置培养时有菌膜形成；通过显微镜观察发现，革兰氏染色阳性，菌体呈杆状(图2).

图1 内生拮抗细菌X1-6-1的菌落形态Figure 1 Colony of endogenous antagonistic bacterium X1-6-1

图2 内生拮抗细菌X1-6-1的革兰氏染色反应Figure 2 Gram of endogenous antagonistic bacterium X1-6-1

根据常见微生物鉴定手册可知，该内生拮抗细菌符合解淀粉芽孢杆菌(Bacillusamyloliquefaciens)的生理生化特征.

2.2 分子生物学鉴定

菌株X1-6-1的16S rDNA的PCR扩增得到了1条1 500 bp左右大小的条带，将测序所得到的1 464 bp DNA序列与NCBI数据库BLAST比对.与其同源性较高的菌株均属于芽孢杆菌属，菌株X1-6-1与BacillusVelezensis、Bacillusamyloliquefaciens相似性超过99%，构建系统发育树可以看出与BacillusvelezensisCR-502T聚于一个分支，亲缘关系较近.综合形态观察和生理特征及16S rDNA序列分析，将X1-6-1鉴定为贝莱斯芽孢杆菌(BacillusVelezensis).

表1 内生拮抗细菌X1-6-1的生理生化特征

图3 内生拮抗细菌X1-6-1 16S rDNA序列系统发育树Figure 3 Phylogenetic tree of endogenous antagonistic bacterium X1-6-1 based on the 16S rDNA gene sequences

2.3 内生拮抗细菌X1-6-1的抑菌作用测定

内生拮抗细菌X1-6-1 对棉花枯萎等8种植物病原真菌表现出不同程度的抑菌效果(表2，图4)，抑菌率为(49.1±0.9)%～(67.3±0.7)%，抑菌谱较广.其中对油菜菌核病菌和葡萄炭疽病菌、葡萄灰霉病菌、棉花炭疽病菌和西瓜蔓枯病菌抑菌率均超过60%；对油菜菌核病菌、葡萄灰霉病菌和葡萄炭疽病菌抑菌带超过5 mm.综合抑菌率及抑菌带宽度来看，内生拮抗细菌X1-6-1对核盘菌属、葡萄孢属和炭疽菌属的真菌抑制效果较好.

表2 内生拮抗细菌X1-6-1对8种植物病原菌真菌的抑制作用

A-H分别为油菜菌核病菌、葡萄灰霉病菌、葡萄炭疽病菌、棉花炭疽病菌、西瓜蔓枯病菌、马铃薯立枯病菌、辣椒根腐病菌、大麦条纹病菌.A-H They respectively are Sclerotinia sclerotiorum，Botrytis cinerea，Colletortrichum gloeospriodes，Colletortrichum gossypii Southw，Didymella bryoniae，Rhizoctonia solani，Fusarium oxysporum，Drechslera graminea.图4 内生拮抗细菌X1-6-1对8种植物病原真菌的拮抗谱Figure 4 Inhibition zoncs of endogenous antagonistic bacterium X1-6-1 against 8 pathogenic fungi

2.4 内生拮抗细菌X1-6-1发酵培养基成分及条件优化

单因素试验表明不同培养基组分及培养环境对菌株生长量有不同程度的影响(图5).对比OD600和活菌数可知菌株的最适培养基为：碳源为可溶性淀粉，氮源为牛肉膏，无机盐为氯化镁.最佳培养条件为：培养时间60 h，装液量90 mL，温度25 ℃，转速为210 r/min，pH 7.0.

2.5 发酵条件优化正交试验

根据上述单因素试验结果，各因素对X1-6-1菌体生物量都有影响，但影响较为显著的因素有发酵时间(A)、培养温度(B)和装液量(C).设计正交试验，进一步确定影响X1-6-1菌株菌体发酵各因素的最佳配比(表3).

R值(极差)的大小顺序(RB>RC>RA)表明影响菌体生物量的因素强度由强到弱依次为培养温度、装液量和培养时间.K值反映每个因素在3个不同水平中菌体生物量的差异.从3个因素各自的K1、K2、K3中选择最大值，获得每个因素的最优水平；结合K值，适合菌株X1-6-1菌体发酵的最优组合为培养时间72 h、培养温度25 ℃、装液量110 mL、转速210 r/min、pH为7.0.

A：不同碳源；B：不同氮源；C：不同无机盐；D：不同培养时间；E：不同装液量；F：不同温度；G：不同转速；H：不同pH.A:Different carbon source；B：Different nitrogen source；C：Different inorganic salt；D：Different culture time；E：Different broth content；F：Different temperature；G：Different rotate speed；H：Different pH.图5 不同培养条件对X1-6-1菌体生长量的影响Figure 5 Effects of different culture conditions on growth of X1-6-1

表3 发酵条件优化正交试验结果及极差分析

3 讨论

芽孢杆菌属由于其具有较好的抑制植物病原菌的能力，又因其产生的芽孢具有很强的抗逆性，有利于生防菌剂的生产、剂型加工及在环境中存活、定殖与繁殖被广泛用于农业领域[9-10].贝莱斯芽孢杆菌(Bacillusvelezensis)是芽孢杆菌属的一个新种，作为一种新型生防菌，在2008年被确定为解淀粉芽孢杆菌的后期异型体[11]，除具有与解淀粉芽孢杆菌相似的拮抗作用和诱导植株抗性作用外，还能产生最佳乳化活性的生物表面活性剂，对后期在植物和土壤中定殖具有很大的应用价值[12].近几年，已有学者对贝莱斯芽孢杆菌进行了一些研究并报道，发现其对马铃薯枯萎病菌(Fusariumsolani)、灰葡萄孢菌(Botrytiscinerea)、黄单胞菌(Xanthomonasoryzaepv.oryzicola，Xoc)、蓝莓根腐病(Fusariumoxysporun)、棉花黄萎病菌(VerticilliumdahliaeKleb)、白菜黑斑病菌(Alternariabrassicae)等多种植物病害病原有一定的拮抗作用[13-18].由于其在农业生产上具有广谱抗菌活性，是开发生物药剂潜力较大的微生物.

本试验获得的内生拮抗细菌B.velezensisX1-6-1抑菌谱较广，抑制的病原菌种类涉及核盘菌属(Sclerotinia)、炭疽菌属(ColletotrichumCorda)、镰孢菌属(Fusarium)、葡萄孢属(Botrytis)和丝核菌属(Rhizoefonia).因此，拮抗内生细菌X1-6-1是一株具有潜在应用前景的生防菌株.芽孢杆菌作为一类防治植物病害的重要生物资源，其主要抑菌物质来源于自身产生的蛋白、脂肽、挥发类物质，并能促使植株分泌一定的拮抗物质及促生长物质[19-22].后续研究将在本研究基础上，分离纯化菌株发酵液的主要抑菌活性成分，深入探究B.velezensisX1-6-1的抑菌机理、防病效应及其稳定性.

发酵培养液不仅为生防菌株提供生长和繁殖所需的营养物质，还是合成代谢产物的基础.因此，发酵培养液的组分以及培养条件对充分发挥微生物生产能力具有关键作用.本研究从发酵培养基营养成分和发酵条件探究了菌株生长的最适条件.单因素试验结果显示，可溶性淀粉作为碳源，牛肉膏作为氮源，MgCl2作为无机盐时最有利于X1-6-1菌体生物量的积累.在优化发酵条件方面，采用正交设计优化，结果表明X1-6-1菌株最适发酵条件为初始pH 7.0，培养时间72 h，温度25 ℃，转速为210 r/min，最佳装液量为110 mL.有学者研究表明生防细菌的最优碳源为葡萄糖[23]，而X1-6-1菌株在碳源为可溶性淀粉时产生的菌体生物量略高于葡萄糖，由此可见不同的生防细菌发酵最适培养基与培养条件差异较大，对菌株进行培养基组分和发酵条件优化很有必要.

4 结论

从葡萄叶片中分离获得的内生拮抗细菌X1-6-1为贝莱斯芽孢杆菌.该菌株最适培养基为：可溶性淀粉10.0 g/L，牛肉膏10.0 g/L，MgCl25.0 g/L；正交试验优化最佳培养条件为：培养时间72 h，温度25 ℃，初始pH值为7.0，转速为210 r/min，最佳装液量为110 mL.抑菌试验表明B.velezensisX1-6-1对油菜菌核病菌和葡萄炭疽病菌、葡萄灰霉病菌、棉花炭疽病菌、西瓜蔓枯病菌、马铃薯立枯病菌和辣椒根腐病菌抑菌率均超过50%，对油菜菌核病菌、葡萄灰霉病菌和葡萄炭疽病菌抑菌带超过5 mm.综合来看，内生拮抗细菌X1-6-1对核盘菌属、葡萄孢属和炭疽菌属的真菌抑制效果较好，为下一步发酵液拮抗效果测定以及田间实际应用提供了理论参考.