苦荞蔗糖合酶SuSy基因在大肠杆菌中的表达及其纯化

2020-07-21李慧婧魏玉梅吴慧昊

甘肃农业大学学报 2020年3期

李慧婧，魏玉梅，吴慧昊

(西北民族大学实验教学部，甘肃兰州 730000)

蔗糖合酶(sucrose synthase，SuSy)是与蔗糖代谢密切相关的一类关键酶，通常以四聚体形式广泛存在于高等植物中[1]，催化可逆反应蔗糖+UDP果糖+UDPG，即在UDP存在时，将蔗糖分解成UDP-葡萄糖和果糖[2]，通常认为该酶偏向蔗糖的裂解反应[3].由于UDPG可以作为合成糖苷等糖基化合物的供体，因此该酶是一种糖基转移酶[4].在细胞中，SuSy因存在形式不同而功能不同，如在细胞质中以可溶性形式存在时，主要为淀粉的合成提供产物[5]，而结合在质膜上时，为纤维素的合成提供前提物质UDPG[6].此外，该酶在提升植物固氮能力[7]和提高植株抗逆性方面也有着重要意义[8].

已有研究表明，玉米中缺失SuSy基因会导致种子淀粉含量明显减少[9]，而当其大量表达时，淀粉和葡萄糖含量又显著升高[10]，当玉米sh1基因发生突变时，种子胚乳中的SuSy活性明显降低，淀粉含量也会下降[11]；西瓜‘04-12’(自交系)在幼果期时，蔗糖的快速积累与SuSy的活性上升关系紧密[12].与其他作物相比，苦荞淀粉具有低消化性、可溶性糖含量明显较低[13-14]，因而被作为糖尿病人首选食疗作物.可以推测，SuSy在苦荞种子淀粉合成、糖代谢调控过程中也发挥着重要作用.燕雪芬等[15]已从苦荞中克隆了SuSy基因，并分析了基因序列.为了进一步探讨SuSy在苦荞中的生物学功能，首先要获得纯化的蛋白，但目前通过原核表达系统表达SuSy重组蛋白方面的报道较少.因此，本研究拟构建苦荞重组表达载体pET28a-SuSy，诱导其在大肠杆菌BL21中表达，亲和层析纯化重组蛋白，为进一步研究该酶的结构和功能及多克隆抗体制备奠定基础[16].

1 材料与方法

1.1 试验材料

苦荞cDNA文库中克隆得到的重组质粒、E.coliTop10由西北农林科技大学生科院酶学实验室保存并馈赠.原核表达载体pET28a、E.coliBL21、DNA Marker、PCR产物回收试剂盒、质粒DNA小量抽提试剂盒购自TaKaRa公司.EcoRⅠ、SalⅠ购自Fenmental公司；PfuTurbo DNA聚合酶购自Stratagene公司；T4DNA ligase购自上海生工公司.钴离子螯合层析介质Talon resin 购自Clontech公司.His-tag鉴定相关试剂购自Pierce公司.

1.2 引物设计与目的基因的扩增

以苦荞cDNA文库中克隆得到的重组质粒为模板，选择完整ORF(1 473 bp)中去除编码信号肽后的序列设计引物，上游引物P1：5′-CGGCCGGAATTCACCACCTGCGGTCAGCGTC-3′(下划线处为EcoRⅠ酶切位点)，下游引物P2：5′-GCACGCGTCGACTTATCACTCCTCAATAGC

CAATGGAACA-3′(下划线处为SalⅠ酶切位点).PCR扩增反应体系为25 μL，包括模板1 μL，10×PCR buffer 2.5 μL，上游引物P1(20 mmol/L)和下游引物P2(20 mmol/L)各0.5 μL，dNTP(10 mmol/L)0.5 μL，MgSO4(35 mmol/L)1.5 μL，pfuTurboDNA聚合酶0.5 μL，超纯水补加至25 μL.PCR扩增程序为：95 ℃预变性2 min；95 ℃变性15 s，50 ℃退火30 s，72 ℃延伸1 min，30个循环；72 ℃延伸10 min.琼脂糖凝胶电泳检测，PCR产物回收试剂盒回收产物.

1.3 原核表达载体的构建

用EcoRⅠ和SalⅠ分别对PCR产物和载体pET28a进行双酶切，琼脂糖凝胶电泳回收后，用T4DNA ligase 于16 ℃连接过夜，将连接产物转入Top10感受态细胞，涂布在有卡那霉素(终浓度为100 μg/mL)的LB平板上.经菌落PCR验证为阳性的克隆，提取其质粒进行双酶切和测序鉴定，将其命名为pET28a-SuSy.

1.4 不同条件下重组蛋白SuSy的表达及表达形式分析

将阳性克隆质粒pET28a-SuSy转入BL21感受态细胞，涂布在LB平板上过夜培养，挑取单菌落接种于5 mL含卡那霉素的LB液体培养基中(终浓度为50 μg/mL)，37 ℃培养，待OD600为0.8时取出备用.将备用菌液按1∶100接种于LB液体培养基中.

1.4.1 不同诱导温度和不同IPTG浓度下的表达分别置于25、28、37 ℃培养，检测OD600为0.8时，分别向菌液中加入终浓度为1.0 mmol/L IPTG，诱导6 h.37 ℃培养时分别加入终浓度为0.2、0.4、0.6、0.8、1.0、1.2 mmol/L的IPTG，诱导6 h 后， SDS-PAGE检测，分离胶浓度为12.5 %.

1.4.2 不同诱导时间下的表达 25 ℃培养，检测OD600为0.8时，加入终浓度为1.2 mmol/L IPTG，诱导2、4、6、8、10 h后，SDS-PAGE检测.

1.4.3 表达形式的分析将备用菌液按1∶100接种于20 ml LB液体培养基中，加入终浓度为1 mmol/L的 IPTG，诱导6 h，10 000 r/min离心10 min收集菌体，加入1/10体积的超声裂解液(pH 8.0，50 mmol/L Tris-HCl，50 mmmol/L NaCl)20 ℃过夜，超声波破碎10 min，功率30 w，间隔时间10 s，破碎后将菌液12 000 r/min离心15 min，取上清和沉淀进行SDS-PAGE检测.

1.5 目的蛋白的纯化及His-tag鉴定

1.5.1 亲和层析纯化向上述沉淀中加入适量洗涤缓冲液I[17](1.5 mol/L NaCl，2 % TritonX-100，20 mM EDTA)充分悬浮后再次离心，向沉淀中加入适量缓冲液II(1×PBS，4 mol/L尿素)、涤缓冲液III(pH 8.0，50 mmol/L Tris-HCl，50 mmol/L NaCl，1 % TrionX-100，2 mol/L尿素)洗涤重悬，共洗涤5次，最后收集沉淀.4 ℃，8 mol/L尿素[17]将其充分溶解，缓慢上样于钴离子亲和层析柱，平衡缓冲液(1×PBS，8 mol/L尿素)洗脱杂蛋白，150 mmol/L咪唑洗脱目的蛋白，4 ℃过夜透析，透析液pH 8.0，20 mmol/L Tris-HCl，50 mmol/L NaCl.

1.5.2 His-tag鉴定取透析后样品进行SDS-PAGE，取出凝胶，脱色液固定1 h后用超纯水洗涤两次，弃超纯水.50 mL特殊染色液染色6 min后用超纯水洗涤，每次10 min.弃超纯水，向凝胶中加入50 mL组氨酸标签显色试剂，温和振荡15 min，再用超纯水洗涤凝胶2次，紫外凝胶成像系统拍照.

1.5.3 重组蛋白的复性用8 mol/L尿素溶解洗涤后的包涵体，分别用3种方法尝试复性[18].方法1：溶液Ⅰ(pH 9.0，20 mmol/L Tris-HCl，50 mmol/L NaCl，6 mol/L尿素)透析，每12 h分别更换1次尿素浓度为4、2 mol/L的溶液；方法2：用溶液Ⅱ(pH 8.0，20 mmol/L Tris-HCl，50 mmol/L NaCl，4 mol/L尿素，1 mmol/L EDTA，20 mmol/L β-巯基乙醇)透析，24 h后尿素浓度换为2 mol/L；方法3：用溶液Ⅲ(pH 8.0，20 mmol/L Tris-HCl，1 % TritonX-100，10 %甘油)复性，10 h后更换为pH 8.0，20 mmol/L Tris-HCl，10 mmol/L甘氨酸，10 mmol/L EDTA的溶液.分别取1 mL透析后样品，12 000 r/min，4 ℃离心20 min，取上清，丙酮沉淀3 h后，用80 %丙酮洗涤5次后加入适量上样buffer，进行SDS-PAGE分析.

2 结果与分析

2.1 苦荞SuSy基因的扩增

电泳结果如图1所示，在1 000～2 000 bp之间有1条特异DNA条带(图1)，大小与预期结果一致.

M：DL2000 DNA maker；1：SuSy基因的PCR产物.M：DL2000 DNA maker；1：PCR products of SuSy gene.图1 苦荞SuSy基因的PCR扩增Figure 1 Amplification of SuSy genes

M:DL2000 DNA maker;1:重组质粒EcoRⅠ和SalⅠ的双酶切鉴定；2：重组质粒的PCR产物.M:DL2000 DNA maker;1:Digestion of pET28a-SuSy by EcoRⅠ和SalⅠ；2：PCR products of pET-28a-SuSy.图2 重组质粒pET-28a-SuSy的PCR和双酶切鉴定Figure 2 Identification and restriction enzyme degestion of recombinant vector pET-28a-SuSy

2.2 原核表达载体的构建

重组质粒pET28a-SuSy进行PCR扩增和双酶切的结果如图2所示，大小与预期相符，且测序结果证实成功构建了重组表达载体.

2.3 苦荞SuSy的表达及表达形式的分析

如图3A所示，经IPTG诱导后，只有含重组质粒的菌液在约53.4 ku处表达了目的蛋白，结果与预期大小相符；未表达目的蛋白的有：只转入pET28a的菌液、转入pET28a-SuSy但未经诱导的菌液、未转入质粒的菌液.目的蛋白SuSy诱导表达成功.如图3B所示，经超声裂解后的重组表达菌液，上清(2号泳道)中无蛋白表达，而在沉淀中(3号泳道)53.4 ku处有明显的条带，这说明苦荞蔗糖合酶在E.coli.BL21中以包涵体形式存在.

2.3.1 不同诱导温度和不同IPTG 浓度对SuSy表达量的影响如图4A所示，当IPTG浓度相同时，目的蛋白在25、28 ℃的表达量前者高于后者，但在37 ℃时表达量较25 ℃明显升高，由此可见，37 ℃的表达量最高.如图4B所示，温度相同时，目的蛋白表达量在0.2 mmol/L时最低，0.4、0.6、0.8 mmol/L时变化不明显，1.0 mmol/L时略微升高，随着IPTG浓度的继续增大至1.2 mmol/L时表达量最高.

A:SuSy的诱导表达，M：蛋白质marker；1：重组对照；2：重组诱导；3：空质粒对照；4：空质粒诱导；5：未诱导菌；6：诱导空菌.B：SuSy表达形式的分析，M：蛋白质marker；1：未诱导菌裂解液；2：超声破碎后上清；3：超声破碎后沉淀；4：全菌体蛋白.A： Expression of SuSy，M：Protein marker；1：Non-induced pET28a-SuSy；2：Induced pET28a-SuSy；3：Non-induced pET28a；4：Induced pET28a；5：Non-induced control；6：Induced bacteria.B：Forms analysis of SuSy，M：Protein marker；1：Lysates of non-induced bacteria；2：Supernatant from induced bacteria；3：Precipitation from induced bacteria；4：Total lysates from induced bacteria.图3 重组蛋白SuSy的表达及表达形式鉴定Figure 3 Expression and forms analysis of SuSy

A：不同温度下的表达，M：蛋白marker；1：未诱导菌；2：1～4分别为25、28、37 ℃诱导菌.B：不同IPTG浓度下的表达，M：蛋白marker；1：未诱导菌；2～7：分别经0.2、0.4、0.6、0.8、1.0、1.2 mmol/L IPTG诱导菌.A：SuSy expression at different time，M：Protein Marker；1：Non-induced bacteria；2：1～4:induced bacteria with 25,28,37 ℃,respectively.B：Susy expression at different IPTG concentration，M：Protein marker；1：Non-induced bacteria；2～7：Induced bacteria with 0.2，0.4，0.6，0.8，1.0，1.2 mmol/L IPTG，respectively.图4 SuSy在不同温度和不同IPTG浓度下的表达Figure 4 SuSy expression at different time and IPTG concentration

2.3.2 不同时间对SuSy表达量的影响如图5所示，37 ℃、IPTG终浓度为1.2 mmol/L诱导至2 h 时，目的蛋白的表达量最低，随着时间的增加，其表达量也在逐渐增加，10 h时表达量最大.

2.4 融合蛋白的纯化

2.4.1 包涵体的洗涤和亲和层析如图6A所示，与洗涤前(泳道1)比较而言，多次洗涤和溶解后的重组蛋白包涵体(泳道2-4)已被除去大量杂蛋白，亲和层析柱纯化后结果如图6B所示，纯化的单一条带与预期相符，说明目的蛋白SuSy纯化成功.

2.4.2 目的蛋白的His-tag鉴定将纯化的目的蛋白进行SDS-PAGE，考马斯亮蓝R-250染色(图7-B)与His-tag试剂鉴定(图7-A)的结果相比较可以看出，试验纯化所得蛋白即带有His标签的重组蛋白.由于图7-B所用蛋白Marker带His标签，所以在紫外成像时也显色.

M：蛋白Marker；1：未诱导菌；2～6：诱导2、4、6、8、10 h的菌液.M：Protein marker；1：Non-induced bacteria；2～6：Induced bacteria at 2,4,6,8,10 h,respectively.图5 SuSy在不同诱导时间的表达Figure 5 SuSy expression in different induction time

A：包涵体电泳检测，M：蛋白marker；1：未洗涤包涵体；2～4：洗涤后包涵体.B：亲和层析纯化后蛋白，M：蛋白marker；1：纯化后的蛋白.A：SDS-PAGE of inclusin bodied，M：Protein marker；1：Unwashed inclusion bodies；2～4：Inclusion bodies after washing.B：Purified SuSy proteinby affinity chromatography，M：Protein marker；1：Purified protein.图6 纯化SuSy的SDS-PAGEFigure 6 SDS-PAGE of purified SuSy

2.4.3 复性蛋白检测将尝试复性后的蛋白进行SDS-PAGE分析，结果如图8所示，透析后目的蛋白都在沉淀里，而上清中无目的蛋白，说明透析后没有得到复性的蛋白.

3 讨论

保守结构域分析表明，苦荞SuSy含有1个GT1糖基化酶功能结构域和4个ADP结合位点，能够催化果糖-6-磷酸和尿苷-5′-二磷酸葡萄糖形成蔗糖-6-磷酸[15].而SuSy在苦荞中发挥的生理功能还有待进一步证实.本试验构建了原核表达载体pET28a-SuSy，实现了重组蛋白在大肠杆菌 BL21中的高效表达，在37 ℃、1.2 mmol/L IPTG诱导10 h 时表达量最高，最终以包涵体形式存在.外源基因利用大肠杆菌系统表达蛋白，有时易形成包涵体[19]，原因复杂，可能由于苦荞SuSy的二级结构[15]的组成，使得变性二硫键的正常形成、肽链正确折叠恢复到原来的构象比较困难.怎样才能获得可溶性表达的蛋白是后续需要解决的问题.已有研究表明，通过优化培养基和降低温度[20]，或是利用共表达热激分子伴侣(如GroEL等)的方法，可以促进外源蛋白正确折叠和高水平可溶性表达[21].

在体外大量表达蛋白质时，常通过分子克隆的方法，在目的蛋白的N端加入表达标签以构建重组融合蛋白，该标签能够与亲和层析柱可逆性、特异性地结合，从而有效分离含有目的蛋白质的重组蛋白，常见的表达标签有His-tag.1975年，金属螯合亲和层析第1次被用于纯化蛋白[22]，因其分离过程简单、快速、分辨率高，已在生物分离中广泛应用.本试验选用原核表达载体pET28a，具有蛋白表达量高、自身带有His-tag的优点，在SuSy蛋白的N端引入pET28a所带标签，其中的组氨酸能够与金属离子Co2+发生相互作用而紧密结合，在洗脱过程中，凝胶介质与目的蛋白牢固结合，从而达到分离纯化的目的.纯化出的重组蛋白可以不用事先切掉6×His-tag便用做抗原产生抗体[22]，为制备苦荞蔗糖合酶的多克隆抗体奠定基础.

A：His-tag 鉴定，M：蛋白Marker；1～2：His-tag鉴定后的目的蛋白.B：考马斯亮蓝R-250染色，M：蛋白Marker；1～2：考马斯亮蓝R-250染色后的目的蛋白.A：His-tag of SuSy，M：Protein marke ；1～2：His-tag staining of purified protein.B：Coomassie brilliant blue R-250 staining，M：Protein marker;1～2：Coomassie brilliant blue R-250 staining of purified protein.图7 纯化后SuSy的His-tag检测Figure 7 His-tag of purified SuSy

M：蛋白marke；1～3：复性后沉淀;4～6：复性后上清.M：Protein marker ；1～3：Supernatant after renaturation,respectively；4～6：Precipitation after renaturation,respectively.图8 包涵体复性结果分析Figure 8 The SDS-PAGE analysis of incusion bodies refolding