高温纤维素降解微生物的筛选、鉴定及其酶活力测定

李建树，孙丽坤，韩向敏，张明盩

(1.甘肃农业大学动物科学技术学院，甘肃 兰州 730070；2.兰州市畜禽育种推广中心，甘肃 兰州 730000)

我国是畜禽养殖业和农业种植大国，而畜禽养殖业产生的大量粪便及农作物秸秆焚烧会对环境造成严重的污染[1-2].而微生物堆肥是农业和养殖废弃物处理的最佳方式之一，可将粪便及秸秆转化为更安全、更稳定的肥料[3-4].

在微生物堆肥中，通过调节原料最初的碳氮比来满足微生物的生长需要，提高堆肥效率[5].农作物秸秆中含有大量的木质纤维素，然而木质纤维素结构复杂，是制约堆肥效果的关键因素[6-7].高温堆肥能够使堆肥中绝大多数木质纤维素等高分子化合物结构断裂或分解[8-9]，但高温会使大量微生物受到抑制或死亡，影响堆肥中木质纤维素的降解[10-11].研究结果表明，添加纤维素降解微生物，特别是高温降解微生物，能够加快纤维素降解，促进堆肥腐熟，提高堆肥效率[12-15].大多数真菌在堆肥温度高于50 ℃时死亡，嗜热真菌保持在较低水平，通常细菌为主要的分解微生物[16-17].目前国内在高温纤维素降解微生物的研究主要为芽孢杆菌属(Bacillus)的微生物，如枯草芽孢杆菌 (Bacillussubtilis)、淀粉芽孢杆菌 (Bacillusamyloliquefaciens)等，而单一菌种的降解能力有限，且不稳定[14，18-20].所以，进一步筛选出能够适应高温，且在高温条件下高产纤维素酶的纤维素降解真菌及其他属的纤维素降解细菌的研究是非常必要的.

本试验以采自自然堆肥的牛粪样品为菌源，在50 ℃条件下以CMC-Na为唯一碳源进行富集、筛选高温纤维素降解微生物.并在50 ℃培养条件下进行其酶活力及滤纸降解能力研究，旨为构建高效纤维素降解复合菌系及研制高温堆肥菌剂奠定基础，为畜禽粪便和农作物秸秆资源化利用的堆肥技术提供参考.

1 材料与方法

1.1 试验材料

1.1.1 样品采集 牛粪采自兰州市榆中县吉将牧业科技有限公司的自然堆肥中，玉米秸秆采自兰州永登县.

1.1.2 试剂及仪器 羧甲基纤维素钠、微晶纤维素、刚果红、肉汤培养基、细菌真菌基因组DNA提取试剂盒，DNS试剂、柠檬酸钠缓冲液(0.1 mol/L pH 4.5)、1%CMC-Na溶液、1%微晶纤维素溶液、定量滤纸.

高压灭菌锅、超净工作台、恒温震荡培养箱、生化培养箱、台式高速冷冻离心机、PCR仪、微量分光光度计(NanoDrop).

1.1.3 培养基 富集培养基参考文献[21]所述配置.细菌的分离及纯化采用牛肉膏蛋白胨培养基.真菌的分离及纯化采用马铃薯-葡萄糖培养基(PDA).刚果红培养基参考文献[22](略作改动)配制：K2HPO4为0.5 g/L，MgSO4·7H2O为0.25 g/L，微晶纤维素为1.88 g/L，刚果红为0.3 g/L，明胶为2 g/L，琼脂为20 g/L，pH7.0，121 ℃高压蒸汽灭菌20 min.滤纸条无机盐培养基参考文献[23]配置.液体发酵产酶培养基[24]：取2 g烘干成恒质量的玉米秆(长度1 cm左右)，加入到Mandel’s无机盐营养液，KH2PO4为1.0 g/L，(NH4)2SO4为3.00 g/L，MgSO4·7H2O为0.4 g/L，CaCl2为0.1 g/L，FeCl3为0.01 g/L，NaCl为0.20 g/L，121 ℃高压蒸汽灭菌20 min.

1.2 试验方法

1.2.1 菌株的筛选 称取5 g样品加入到100 mL含有CMC-Na的富集培养基中，120 r/min，50 ℃恒温震荡富集，在培养基变浑浊后，吸去2 mL转移至新的富集培养基中进行多次富集.取1 mL稀释成10-3、10-4、10-5和10-64个梯度，再依次吸去100 μL分别涂布于牛肉膏蛋白胨、高氏一号、PDA培养基平板上50 ℃恒温培养.待平板上长出菌落1 d后，挑选形态不同的单菌落进行分离纯化.将纯化好的菌株接种至刚果红培养基上进行筛选，根据培养基上水解圈的直径(D)和菌落直径(d)的比值(D/d)，选取效果较好的进行下一步研究(滤纸条崩解试验).

将初选得到的菌株接种至液体培养基中50 ℃恒温震荡培养，调节OD值至0.6.在98 mL滤纸条培养基中接入2 mL菌液，在50 ℃、80 r/min下培养7 d，空白组不接种菌种，每组3个重复.根据滤纸条的断裂崩解程度及降解率来判断菌株的降解性能.

1.2.2 酶活力的测定 标准曲线的绘制参考文献[25-27]，以吸光度为纵坐标，以溶液浓度横坐标，绘出标准曲线(图1).最终测得葡萄糖标准曲线为y=0.783 6x-0.030 5(R2=0.995).

图1 葡萄糖标准曲线Figure 1 Glucose standard curve

粗酶液的制备 在三角瓶中装入98 mL发酵产酶培养基，将筛选的菌株菌液吸取2 mL接种到发酵产酶培养基上，180 r/min、50 ℃振荡培养.在培养2、3、4、5、6、7 d时取培养液，培养液于4 ℃、6 000 r/min离心10 min，上清液为粗酶液.

羧甲基纤维素酶活(CMCase)测定[25]取1 mL稀释后的粗酶液(5倍)至试管中，加1 mL 1%CMC-Na溶液和1 mL柠檬酸缓冲液(0.1 mol/L pH 4.5)，混匀后，于50 ℃水浴30 min，然后加入DNS显色液1.5 mL立即沸水浴5 min，冷却后定容至20 mL后在530 nm比色.同时用100 ℃煮沸10 min后失活的酶液做对照，其他步骤相同，每组3个平行.

滤纸酶活(FPA)测定[26]同羧甲基纤维素酶活测定，将底物CMC-Na溶液换为1 cm×6 cm滤纸，其它步骤相同.

微晶纤维素酶C(1)活测定[27]吸取1 mL稀释后的粗酶液(5倍)至刻度试管中，加入1 mL的柠檬酸缓冲液(0.1 mol/L pH 4.5)和1 mL 1%微晶纤维素溶液，50 ℃反应120 min，6 000 r/min离心10 min除去沉淀.然后取1 mL反应上清液用DNS法测定还原糖(同羧甲基纤维素酶活测定).

1.2.3 分子生物学鉴定 菌株的DNA提取 按照细菌基因组提取试剂盒和真菌基因组提取试剂盒的操作步骤分别提取菌株的基因组DNA.提取的DNA用NanoDrop检测浓度(ng/μL)及纯度(A260/A280)，用1.2%的琼脂糖凝胶电泳检测DNA的完整性.

PCR扩增及测序 以提取的细菌基因组DNA为模板，选用细菌通用引物(上游引物27F：5′-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3′，下游引物1492R：5′-GGTTACCTTGTTACGACTT-3′)进行PCR扩增.扩增体系(25 μL)为DNA模板0.5 μL，上下游引物各1 μL，PCR Master Mix 12.5 μL，ddH2O 10 μL.程序为95 ℃ 3 min；95 ℃ 60 s，55 ℃ 60 s，72 ℃ 60 s，30个循环；72 ℃延伸5 min，4 ℃保存.真菌通用引物ITS1 (5′-TCCGTAGGTGAACCTGCGG-3′)和ITS4 (5′-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3′)进行PCR扩增.扩增体系(25 μL)为DNA模板2 μL，上下游引物各1 μL，PCR Master Mix 12.5 μL，ddH2O 8.5 μL.程序为94 ℃ 5 min；94 ℃ 30 s，56 ℃ 30 s，72 ℃ 60 s，35个循环；72 ℃延伸5 min，4 ℃保存.

PCR产物用1.2%琼脂糖凝胶电泳检测，用凝胶成像分析仪观察结果.将阳性PCR产物送至北京奥科鼎盛生物科技有限公司利用Sanger法进行16S rDNA和ITS测序分析.

1.3 数据处理

数据采用Excel2010对试验数据进行初步处理和图表的绘制.用SPSS21.0软件对数据进行显著性分析，测序结果在NCBI(National Center of Biotechnology Information)上用BLAST(Basic Local Alignment Search Tool)程序与GenBank中微生物基因序列进行同源性分析.

在NCBI中下载比对相似度高的序列及种属参考序列，用Mega7.0进行序列比对分析后，用Phylogeny菜单中的Construct/Test Neighbor-joining Tree方法构建系统发育树.

2 结果与分析

2.1 纤维素分解微生物的分离与筛选

将牛粪堆肥在50 ℃下，4代富集培养以后，将稀释液涂布、分离纯化培养5代后得到4株真菌和5株细菌.

将纯化得到9株菌株在刚果红培养基上，筛选出5株水解圈与菌落直径比值大于2.0的菌株用于复选(表1).菌株Z-3在刚果红平板上相对较好，菌落直径较大(图2).

由表1可知，初选的5株菌，在50 ℃恒温培养下在2 d时能够在刚果红培养基上产生较好的水解圈.水解圈直径和菌落直径比(D/d)从大到小依次为X-3、X-4、X-5、X-1、Z-3，菌株X-3、X-4、X-5水解圈直径和菌落直径比(D/d)显著高于X-1和Z-3.D/d越大，说明该菌株产生的纤维素酶活性越高，纤维素酶量越大.因此，可以通过D/d的大小初步判断菌株的降解效果，但不能完全代表菌株的产酶能力和菌株降解纤维素的效果.

图2 菌株X-1和Z-3在刚果红培养基上的生长情况Figure 2 Growth of strains X-1 and Z-3 on Congo red medium

表1 纤维素降解微生物的初选结果

通过将初选得到的5株菌接种到滤纸条培养基中，50 ℃恒温培养7 d测定滤纸条的崩解程度.测定结果表明菌株X-1在第5天能够将滤纸完全崩解，Z-3能够在7 d内将滤纸完全降解为糊状，降解效果如图3所示.其他3株菌7 d时只能使滤纸的边缘膨胀，几乎没有降解效果(表2)，而Z-3、X-1、X-3、X-4、X-5的滤纸降解率(7 d)分别为18.86%、16.37%、2.27%、1.89%、0.60%，可看出菌株Z-3和X-1对滤纸具有一定的降解效果，而其它菌株基本对滤纸没有降解效果，将它们淘汰，如图4所示，

表2 菌株的菌落形态及复选

A：菌株X-1；B：菌株Z-3；C：空白对照；D：菌株X-5；E：菌株X-3；F：菌株X-4.A：Strain X-1；B：Strain Z-3；C：Blank control；D：Strain X-5；E：Strain X-3；F：Strain X-4.图3 X-1和Z-3在7 d时对滤纸的降解效果Figure 3 Degradation effect of X-1 and Z-3 on filter paper at 7 d

图4 菌株X-1和Z-3的菌落形态特征Figure 4 Morphology characteristics of strains X-1 and Z-3

菌株X-1和Z-3在50 ℃培养的条件下，在肉汤培养基和PDA培养基上生长较高.菌株X-1和Z-3对滤纸的降解效果较好，有较好的研究效果.

2.2 菌株X-1和Z-3羧甲基纤维素酶活、滤纸酶活和微晶纤维素酶活的测定

经过滤纸条降解试验筛选出的2株降解滤纸效果较好的菌株X-1、Z-3，测定这2株菌的酶活.由图5、图7可知，X-1的羧甲基纤维素酶活(CMCase)和微晶纤维素酶活(C1)第2天开始上升，第5天分别达到0.47、0.12 IU/mL，5 d以后开始下降.滤纸酶活(FPA)第3天达到最高0.08 IU/mL，之后开始下降.由图4、5、6可知，菌株Z-3初期酶活呈上升趋势到4～5 d达到最高，之后开始下降.Z-3的羧甲基纤维素酶活(CMCase)、滤纸酶活(FPA)、微晶纤维素酶活(C1)在7 d内最高值分别为0.32、0.14、0.07 IU/mL.在7 d内X-1的羧甲基纤维素酶活(CMCase)和微晶纤维素酶活(C1)整体高于Z-3，X-1的滤纸酶活(FPA)第2、3天略高于Z-3，第4～7天低于Z-3.整体2株菌的羧甲基纤维素酶活(CMCase)显著大于滤纸酶活(FPA)和微晶纤维素酶活(C1).

图5 培养时间对菌株X-1和Z-3CMC酶活的影响Figure 5 Effects of culture time on enzyme activities of strains X-1 and Z-3 CMC

图6 培养时间对菌株X-1和Z-3滤纸酶活的影响Figure 6 Effect of culture time on enzyme activity of strain X-1 and Z-3 filter paper

图7 培养时间对菌株X-1和Z-3微晶纤维素酶活的影响Figure 7 Effect of the culture time on the enzyme activity of the bacterial strain X-1 and Z-3 microcrystalline cellulose

2.3 菌株分子的生物学鉴定

PCR产物在凝胶电泳后，菌株X-1的16S扩增片段大小在1 500 bp左右，菌株Z-3的扩增片段大小在550 bp左右(图8).将阳性PCR产物送至北京奥科鼎盛生物科技有限公司测序，所得X-1的16S扩增序列长度为1 424 bp，Z-3的序列长度为554 bp，与预期结果相近.测序结果在NCBI 数据库进行BLAST比对，其同源性都为100%.利用MEGA7.0的Neighbor-Joining 构建系统发育树(图9～10)，结合菌株的菌落形态特征和基因序列比对分析结果及系统发育树分析，鉴定菌株X-1为伯氏短杆菌(Brevibacillusborstelensis)，菌株Z-3为枝孢菌属(Cladosporium).

图8 菌株16S rDNA和ITS琼脂糖凝胶电泳图Figure 8 Agarose get electrophoresis of 16S rDNA and ITS from strains

3 讨论

自然界中存在着许多能产生纤维素酶的细菌真菌，在自然界纤维素的降解过程中发挥作用.目前用于生产纤维素酶的主要菌种大多为丝状真菌以绿色木霉(Trichodermaviride)、里氏木霉(Trichodermareesei)和康氏木霉(Trichodermakoningii)为代表[28].纤维素酶是1个动态变化的多酶体系，在多重酶组成的体系内，不同酶之间，同种酶在不同的发酵时间内的酶活性很不一致.Liu等[29]将斜卧青霉(Penicilliumdecumbens)诱导突变选育的菌株JUA10-1发酵预处理的玉米芯和麸皮生产乙醇的研究中，滤纸酶活达到了8.21 IU.陈静[30]筛选的菌株LY4-5的羧甲基纤维素酶活(CMCase)和滤纸酶活(FPA)分别为41.25、27.63 μg/mL远低于本试验筛选的2株菌，但滤纸失重率达到44.96%.与本试验筛选的2株菌酶活和滤纸降解率差异较显著.

在发酵产酶培养基的选用、发酵温度、测定波长的选择、酶液量等都对酶活测定结果有一定的影响[31].而温度是酶活测定的重要影响因素之一，温度过高或过低都对酶活测定结果造成影响[32].曾思泉等[33]从红树林区分离出的纤维素降解真菌SCSIO43503与本试验分离的菌株Z-3同属枝孢属(Cladosporium)，28 ℃培养后，在pH 5.0时3 d的酶活力最高可达到23.46 IU，高于本试验菌株Z-3在50 ℃培养，3 d时于50 ℃、pH 4.5下反应测得的酶活力，但培养温度远低于本试验.靳然[34]从土壤环境中分离的枝孢菌Bio-3(CladosporiumBio-1)也在28 ℃下培养，8 d内的胞内纤维素酶内切葡聚糖酶最高酶活为2.9 IU/mL，由于培养温度远低于本试验培养温度，所测得酶活力差异较大.说明这类菌株具有够较好温度适应性，且能在高温下产纤维素酶，但产酶量较常温低.

图9 菌株X-1的系统发育树Figure 9 Phylogenetic tree of strain X-1

图10 菌株Z-3的系统发育树Figure 10 Phylogenetic tree of strain Z-3

国内芽孢杆菌(Bacillales)在纤维素降解方面的研究较多[20，35-37]，而主要集中在高温方面.张楠等[20]从牛粪堆肥中筛选出6株高温纤维素降解细菌，其中枯草芽孢杆菌(Bacillussubtilis)在50 ℃下培养接种16 h后羧甲基纤维素酶活(CMCase)达到最高1.21 mg/mL(30 min)，和本试验最高酶活相近，试验筛选的部分菌株能够在3 d内将滤纸完全崩解，略高于本试验结果.王海滨等[38]在45 ℃下筛选的耐高温菌G-13能在5 d内将滤纸完全崩解，与菌株Z-3对滤纸完全崩解的时间一致.Liang等[39]从猪粪中分离出的菌株在补充了微晶纤维素和CMC的培养基中，57 ℃条件下产生的纤维素酶基础水平FPU为0.02 IU/mL，表明短杆菌属(Brevibacillus)可能具有可降解纤维素的功能.伯氏短杆菌(Brevibacillusborstelensis)同为短杆菌属，且能够在高温条件下降解纤维素，在纤维素降解方面的有待进一步深入研究.

4 结论

50 ℃的培养条件下通过富集培养、刚果红水解圈筛选出的5株菌，X-1和Z-3对滤纸的降解效果最好，在7 d内能够将滤纸完全崩解，在7 d时的降解率分别为16.37%和18.86%.经过菌落形态观察和分子鉴定X-1为伯氏短杆菌(Brevibacillusborstelensis)，Z-3为枝孢菌属(Cladosporium).筛选的这2株高温降解菌在培养基上50 ℃恒温培养经过多次纯化后生长较好，降解纤维素能力较强.且菌株X-1在纤维素降解方面研究较少，具有一定的研究价值.