羧甲基壳聚糖-油酸胶束的制备*

2020-07-21李姣姣梁琳琳张雪娇

化工科技 2020年3期

尤静，李姣姣，梁琳琳，张雪娇

(西安医学院药学院，陕西西安 710021)

壳聚糖是一种天然阳离子多糖，对有较多负电荷的肿瘤细胞有选择性吸附和电中和的作用，但同时，水溶性较差和转染效率较低是壳聚糖两大缺点[1-3]。羧甲基化可以增加壳聚糖在水中的溶解度[4-5]。油酸属于不饱和高级脂肪酸，有良好的抗癌作用[6-8]，但是油酸属于脂溶性成分，口服吸收差，生物利用度低。将羧甲基壳聚糖和疏水性的油酸进行接枝，所得到的羧甲基壳聚糖-油酸溶于水时，会自动形成具有内核疏水和外壳亲水的胶束结构，增加疏水性物质的生物利用率，增强靶向性，并有望展现出协同抗癌作用。作者主要研究了以不同取代度羧甲基壳聚糖与油酸催化接枝反应，通过测定聚合物的临界胶束浓度(CMC)来考察不同取代度羧甲基壳聚糖-油酸形成胶束的能力，便于进一步优化羧甲基壳聚糖-油酸聚合物的合成路线。

1 实验部分

1.1 试剂与仪器

壳聚糖：脱乙酰度90%，上海金穗生物科技有限公司；油酸：分析纯，1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺盐酸盐(EDC)：质量分数98.0%，N-羟基琥珀酰胺(NHS)：质量分数98.0%，芘：质量分数97%，上海阿拉丁生化科技股份有限公司；异丙醇、氢氧化钠、一氯乙酸、冰醋酸、甲醇、无水乙醇：分析纯，天津市富宇精细化工公司。

荧光分光光度计：LS55，美国PerkinElmer公司；旋转蒸发仪：RE-2000A，集热式恒温加热磁力搅拌器：DF-101S，巩义市予华仪器有限责任公司；傅立叶变换红外光谱仪：T27，尤尼柯(上海)仪器有限公司；数字电导率仪：DDS-307，上海大唐仪器有限公司；冷冻干燥仪：FD-1，郑州长城科工贸有限公司。

1.2 不同取代度羧甲基壳聚糖(CMCS)的合成

精密称取2 g壳聚糖加入100 mL圆底烧瓶中，加入适量异丙醇，置于集热式恒温磁力搅拌器上，25 ℃搅拌30 min，使其溶胀，然后缓慢加入适量的氢氧化钠溶液，搅拌一定时间以形成碱化中心。取适量氯乙酸，分4次加入以上溶液中，加热至60 ℃反应3 h。

将圆底烧瓶中物质移入烧杯中加10 mL蒸馏水，用冰醋酸调至pH=7.0，抽滤，滤饼用体积分数70%甲醇、体积分数95%乙醇、无水乙醇依次洗涤，所得产物60 ℃烘干，得到淡黄色CMCS，研磨成粉末状密封后待用。

1.3 电导滴定法测定CMCS的取代度

500 mL烧杯中精密加入0.1 mol/L 盐酸标准溶液20 mL， 25 ℃下搅拌并加入精密称量的CMCS 0.1 g使其溶解，再加入200 mL蒸馏水稀释混匀，用0.5 mol/L 氢氧化钠标准溶液滴定，并记录相应电导率值。作电导率-氢氧化钠体积关系图，计算取代度。

1.4 羧甲基壳聚糖-油酸(CMCS-OA)的合成及表征

在圆底烧瓶中加入V(蒸馏水)∶V(甲醇)=1∶4混合液150 mL，缓慢加入精密称取的0.5 g CMCS，置于集热式恒温磁力搅拌器，室温下搅拌1 h使其充分溶解得到CMCS溶液。另精密量取10 mL甲醇于烧瓶中，室温下，边搅拌边加入EDC 0.065 g、NHS 0.039 g、油酸0.15 mL，充分搅拌1 h。用分液漏斗将CMCS溶液缓慢加入其中,搅拌反应24 h后，将反应液置于截留相对分子质量为8 000～14 000的透析袋中用蒸馏水透析48 h，每4 h换1次水。旋蒸，冷冻干燥48 h，即得CMCS-OA。

分别取适量充分干燥的壳聚糖、CMCS、CMCS-OA和溴化钾粉末研磨，压片，测定红外光谱。

1.5 CMCS的CMC测定

配制ρ(芘)=0.1 mg/mL的丙酮溶液作为探针储备，避光放置待用。配制1 mg/mL CMCS-OA母液待用。取12个10 mL棕色容量瓶中各加10 μL探针储备溶液，将丙酮除去，再依次加入不同体积的CMCS-OA母液得到质量浓度分别为0.5、0.25、0.1、0.05、0.025、0.01、0.005、0.002 5、0.001、0.000 5、0.000 25和0.000 1 mg/mL的CMCS-OA溶液。荧光分光光度法在334 nm测定荧光强度，以荧光强度为纵坐标，浓度为横坐标作图，计算聚合物的CMC值。

2 结果与讨论

2.1 不同取代度CMCS的合成

以取代度为指标，参考文献[9-10]的基础上正交实验法(四因素三水平)考察了NaOH质量(A)、异丙醇体积(B)、氯乙酸质量(C)、壳聚糖的碱化时间(D)对CMCS合成的影响，正交实验因素水平表见表1。

表1 因素水平表

表2 合成CMCS正交实验结果L9(34)

表3 方差分析

1) * 表示差异在0.05水平上显著。

由表2和表3可知，4个因素中碱化时间对产物取代度影响最大，最佳制备条件为A3B2C1D2。结合正交实验结果，按制备CMCS方法，投入壳聚糖2 g，异丙醇30 mL，NaOH 8 g，氯乙酸2.4 g，壳聚糖碱化时间分别为1、2、3 h，反应时间3 h，反应温度60 ℃。得到取代度为0.815 9、0.968 7、1.114 5的CMCS。

2.2 CMCS取代度的测定

CMCS分子中同时含有—COOH及脱乙酰化的游离—NH2，将其溶于定量过量的盐酸标准溶液中，游离的—NH2与定量的盐酸发生反应，用NaOH标准溶液滴定时，首先中和过量盐酸，电导率由于H+被中和而迅速减小，反应完全时，出现第1个拐点V1。继续加碱，OH-与—COOH发生反应，生成—COO-，反应完全时，出现第2个拐点V2，第1个至第2个拐点间消耗的氢氧化钠的量即为分子中所含—COOH的量。继续加碱，由于NaOH增多，使电导率迅速上升。得到电导率与消耗氢氧化钠体积的关系图，见图1。

V(NaOH)/mL

根据式(1)、式(2)计算取代度[11-13]。

A=c×(V2-V1)×10-3m

(1)

取代度=0.203A1-0.058A

(2)

式中：c为NaOH标准溶液的浓度，mol/L；V1、V2为NaOH溶液的体积，mL；m为CMCS的质量，g。

2.3 CMCS-OA的制备和表征

在EDC和NHS的催化下将油酸接枝到3种不同取代度的CMCS上，得到3批乳白色CMCS-OA聚合物样品，合成路线见图2。

图2 CMCS-OA的合成路线

壳聚糖、CMCS、CMCS-OA的红外光谱图见图3。

σ/cm-1

2.4 CMCS-OA的CMC的测定

芘是一种强憎水性的荧光探针物质[14-15]，以334 nm为激发波长，扫描的发射光谱具有5个明显的发生峰I1～I5，分别为约372、379、383、390和397 nm。与372 nm处的峰强(I1)相比，383 nm处的峰强(I3)对环境变化最敏感。因此，根据I1/I3变化来研究不同浓度的纳米胶束对芘探针荧光的影响。当聚合物质量浓度小于CMC时，体系中没有胶束存在，I1/I3值保持稳定，但当胶束形成时，芘分布于胶束内核，I1/I3值迅速下降，所以提示在拐点处聚合物开始形成胶束。

分别用取代度为0.815 9、0.968 7、1.114 5的CMCS与油酸反应得到的CMCS-OA(分别标记为CMCS-OA1、CMCS-OA2、CMCS-OA3)测定CMC，见图4，2条直线交点处的浓度即为CMC值。