喀斯特石漠化地区退耕还林对土壤细菌群落的影响

2020-07-21龙家辉蓝家程姜勇祥

农技服务 2020年7期

龙家辉，蓝家程，姜勇祥

(1.贵州师范大学地理与环境科学学院，贵州贵阳 550025； 2.贵州师范大学喀斯特研究院/国家喀斯特石漠化防治工程技术研究中心，贵州贵阳 550001)

贵州是中国西南喀斯特分布的中心，也是石漠化最为严重的地区。从“九五”开始，国家和地方政府相继实施了退耕还林和石漠化治理工程，旨在控制石漠化发展，解决生态与社会经济发展的矛盾。大量研究表明，石漠化治理能够提高土壤肥力，改善土壤结构，增加土壤有机碳[1-2]。然而，石漠化治理生态修复对土壤微生物群落组成的影响报道尚少。土壤微生物参与有机质的分解、腐殖质的形成、养分的转化与循环等过程，是土壤有机质和土壤养分(C、N、P、S等)转化和循环的驱动力[3]，土壤微生物与土壤质量和植物群落的关系密切，可以敏感反应土壤质量的变化[4]。因此，开展喀斯特石漠化地区退耕还林对土壤微生物群落的影响研究，可为喀斯特石漠化区土壤质量恢复和退耕还林选择模式提供科学依据。

研究表明，随着退耕还林由低级阶段向高级阶段发展，土壤微生物数量逐渐提高[4]。喀斯特石漠化区退耕还林对土壤微生物碳、基础呼吸有重要影响，相对于裸露地，退耕还林显著提高了微生物量碳、微生物活性、微生物商、细菌种丰富度及基因多样性[5]。在喀斯特峰丛洼地中由草丛-灌丛-次生林和原生林生态系统，土壤微生物生物量与土壤微生物碳熵呈增加趋势。随着植被演替，表层土壤微生物总量为顶级林>灌丛>乔幼林>灌草丛>草丛[6]。

从已有的研究来看，退耕还林对土壤微生物指标的影响大多从自然恢复的角度进行讨论，缺乏人工林恢复的研究。人工林恢复和自然恢复模式是否改变了土壤细菌群落丰度和多样性，是否有利于向生态恢复方向发展尚未报道。笔者以贵州喀斯特石漠化综合治理示范区关岭花江示范区为试验基地，以耕地为对照，选取人工花椒林和自然退耕还林地，运用高通量测序技术，揭示不同退耕还林样地土壤细菌群落的丰度和多样性的变化特征，以期为喀斯特退耕还林地区土壤保护提供参考。

1 材料与方法

1.1 研究区概况

研究区位于贵州省关岭县花江镇峡谷村喀斯特峡谷石漠化综合治理示范区内(105°36′30″～105°46′30″E, 25°39′13″～25°41′00″N)。该区属典型的亚热带干热河谷气候，年均降雨量1 100 mm，年均气温18.4℃。该区地貌为典型的喀斯特高原峡谷地貌，海拔为450～1 300 m。高原峡谷地貌河谷深切发育，坡度陡峻，水土流失严重，岩石裸露率高、植被覆盖率低，石漠化发育。土壤以碳酸盐岩风化发育的石灰土为主。

1.2 采样设计与方法

以耕地(CL)为对照，选取研究区2种退耕还林模式(自然退耕还林SF、人工花椒林CP)为研究对象。每种地类设置3个样地，每个样地使用无菌袋采集0～10 cm土层原状土壤，8～10个点混合为1个点。

1.3 DNA提取及纯化

用DNA试剂盒提取土壤DNA。使用Nanodrop 2000光谱仪(Thermo Fisher Scientific，Wilmington，DE，United States)测量提取DNA的浓度和纯度。土壤的DNA在使用前一直保存在-20℃。使用引物16S V3～V4区，上游引物338F：ACTCCTACGGGAGGCAGCA，下游引物806R：GGACTACHVGGGTWTCTAAT。通过聚合酶链反应(PCR)扩增细菌16S核糖体RNA基因的V3～V4可变区。使用TransGen AP221-02:TransStart-Fastpfu DNA聚合酶进行PCR扩增，并在GeneAmp 9700热循环仪中进行热循环。PCR反应程序：95℃预变性3 min；95℃变性30 s，退火温度30 s，72℃延伸45 s，35个循环；72℃保持10 min。每个样本3个PCR重复。用2%琼脂糖凝胶电泳检测PCR扩增。使用AxyPrep DNA Gel Extraction Kit凝胶提取试剂盒(United States)纯化扩增产物，PCR产物用QuantusTMFluorometer进行检测定量。使用NEXTFLEX Rapid DNA-Seq Kit进行建库，最后利用Illu mina公司的Miseq PE300平台(上海美吉生物医药科技有限公司)对细菌16S rRNA基因的V3～V4区进行了测序。

1.4 OUT分类

根据学注稀结果，按照门、纲、属3个水平分别提取序列信息，并计算各物种的相对丰度，同时选取相对丰度在1%以上的物种绘制物种相对丰度分布图。

2 结果与分析

2.1 高通量测序数据的优化

质控去除不合格序列后，3个土壤样品中共获得细菌总优化序列 2 372 533条。基于97%相似度，样品CL、CP、SF的OTU数量分别为896 629、757 286和718 618。如图1所示，当序列数达到12 000以上时，曲线逐渐趋于平缓。测序各样品测得序列数均远大于12 000，说明能较好地反映土壤样品中微生物多样性的主要信息。Core物种分析曲线随样本数量的增加趋于平缓，表明此次检测样本数量充足，数据具有可靠性。

2.2 土壤细菌群落分布

由图2可知，CL独有物种多集中在放线菌门7.65%，变形杆菌门 1.58%，芽单胞菌门1.16%，酸杆菌门1.07%，绿弯菌门1.02%；CP独有物种多集中在拟杆菌门2.15%为最多，疣微菌门占有1.27，厚壁菌门1.14%，酸杆菌门1.01%,芽单胞菌门1.01%，Patescibacteria占有1.01%，绿弯菌门1.01%；SF独有物种多集中在拟杆菌门11.16%为最多，放线菌门3.28%，Entotheonellaeota 2.26%，变形杆菌门5.33%，Patescibacteria 1.46%。3种样地共有核心物种(在OUT水平下)有2 220个，独有物种不同，可以说明3种样地在物种组成上具有明显差别。

由图3可知，耕地物种中绿弯菌门(17.79%)显著比其他样地多，花椒地物种在酸杆菌门(18.50%)显著比其他样地多，乔木林物种在放线菌门(43.44%)、变形杆菌门(24.20%)显著比其他样地多。在生态恢复之后，花椒地与耕地相比酸杆菌门具有增加的趋势(5.4%)，乔木林中的放线菌门、变形杆菌门具有增加的趋势，分别增加7.75%和3.99%；厚壁菌门、拟杆菌门、已科河菌门变化不显著；乔木林中芽单胞菌门、绿弯菌门有减少的趋势，分别减少2.11%和5.92%。表明，退耕还林显著提高了土壤中的拟杆菌门、放线菌门的相对丰度，降低了绿弯菌门、芽单胞菌门的相对丰度，而退耕种植花椒显著提高了酸杆菌门的相对丰度。

2.3 土壤细菌群落多样性

由表1可知，不同植被类型土壤细菌多样性指数均无显著差异，样本中观察到的物种数目指数、香农-威纳指数、辛普森指数、群落中含有OTU数目指数和菌种丰富的指数表现为耕地>花椒>次生林，表明退耕还林对土壤细菌多样性影响不显著。基于距离算法对不同退耕还林模式土壤细菌群落组成进行NMDS分析(图4)表明，3种土地利用类型土壤的细菌群落部分组成存在差异，而在花椒地中的部分与耕地的差异并不明显，可能的原因是当地花椒种植年限少，部分退耕年限小于5年，群落构建时间短，所以与耕地细菌群落差异性不明显，而乔木林退耕年限长基本在10年以上，对细菌群落的影响较为显著。