Toll样受体4基因多态性与HBV相关原发性肝癌易感性及预后的关系

赫伟丽，杨笑月，张爱军，王晓阳，王亚军，赵 帆，徐光福

北京中医药大学东直门医院 感染科，北京 100700

原发性肝癌(以下简称为肝癌)是我国最为常见的恶性肿瘤之一，位居世界死因第5位，患者5年生存率仅为7%[1]。目前关于肝癌的致病机理尚不明确，临床普遍认为肝癌的发生主要与HBV、HCV感染有关，此外，遗传因素也是肝癌发生的重要因素之一。研究[2-4]认为，肝癌的发生存在遗传易感性。Toll样受体4(TLR4)是一种髓源性细胞上表达的模式识别受体，可识别革兰阴性菌脂多糖。研究[5]显示，TLR4与肿瘤的发生发展密切相关，尤其是炎症相关性肿瘤，而肝癌便是一种典型的炎症相关肿瘤，常发生于肝炎、病毒性肝炎以及脂肪肝等导致的肝硬化基础之上。有学者[6]报道，TLR4基因多态性与结肠癌、胃癌等发展具有着密切的联系，而关于其与HBV相关原发性肝癌易感性及患者预后关系的研究，尚无相关报道。本研究旨在探讨分析TLR4基因多态性与HBV相关原发性肝癌易感性之间的关系以及对患者预后的影响。

1 资料与方法

1.1 研究对象 选取2015年6月-2017年7月与北京中医药大学东直门医院合作的北京佑安医院收治的HBV相关肝癌患者106例作为肝癌组，同期北京中医药大学东直门医院收治的慢性乙型肝炎患者120例作为乙型肝炎组以及健康对照受试者100例作为对照组。纳入标准：(1)肝癌患者均在北京佑安医院接受手术治疗，肿瘤切除完整，且切缘镜下午肿瘤，术前、术中未见远处转移，术后经病理组织学检查确诊为肝细胞性肝癌；(2)肝癌患者均为HBsAg阳性半年以上和(或)HBV DNA>1×103IU/L；(3)慢性乙型肝炎患者符合《慢性乙型肝炎防治指南(2015年更新版)》[7]中相关诊断标准，且HBsAg阳性半年以上和(或)HBV DNA>1×103IU/L；(4)对照组均为健康的体检志愿者，无心、脑、肾以及内分泌代谢性疾病。排除标准：(1)其他部位恶性肿瘤肝转移患者；(2)合并丙型肝炎、甲型肝炎等其他肝炎病毒感染者；(3)合并代谢性肝病、自身免疫性肝病以及酒精性脂肪性肝病等其他肝脏病变患者；(4)合并其他严重内科疾病或精神疾病患者。

1.2 标本采集及基因组DNA提取 抽取3组受试者清晨空腹肘静脉血5 ml，使用乙二胺四乙酸抗凝，使用上海生工生物工程公司全血基因组提取试剂盒提取基因组DNA，将其置于-20 ℃保存待用。

1.3 PCR引物以及反应条件 分别扩增TLR4 D299G、T399I以及A896G多态性位点基因序列。根据文献[8]设计引物，采用Bio-Rad PCR仪，PCR反应体系为30 μl，包括10×Buffer 3 μl、dNTPs 2.4 μl、上游引物0.9 μl、下游引物0.9 μl、Taq DNA聚合酶0.24 μl、DNA模板2 μl、无酶双蒸水20.56 μl。PCR反应条件为95 ℃预变性4 min，94 ℃ 45 s、55 s(D299G和A896G：56 ℃；T399I：58 ℃)，72 ℃ 1 min，共35个循环，72 ℃ 10 min。取3 μl PCR扩增产物于含溴化乙锭(0.5 μg/ml)的2%琼脂糖凝胶中电泳，采用凝胶成像系统记录电泳结果，每次PCR反应均使用无菌双蒸水作为阴性对照。使用限制性内切酶Nco I酶切上述PCR产物，酶切体系20 μl，包括10×K Buffer 2 μl、10 μ/μl Nco I 1 μl，PCR产物10 μl以及无酶双蒸水7 μl。混匀后瞬时离心，酶切产物于含溴化乙锭的2%琼脂糖凝胶中电泳，采用凝胶成像系统记录实验结果。

1.4 扩增产物检测及分析 取10 μl PCR反应产物，使用10 U BamH I内切酶于37 ℃条件下酶切消化4 h，反应终止后产物经2.5%琼脂糖凝胶电泳，以DNA片段长度标准物作为参考，在紫外灯下观察结果。

1.5 随访 术后对患者进行随访，包括门诊随访、电话随访、微信随访、视频随访等形式，随访间隔不超过3个月，以术后复发作为随访终点，包括局部复发与远处转移，随访截止日期为2019年8月31日。

1.6 伦理学审查 本研究经北京中医药大学东直门医院伦理委员会批准同意(批号：ECPJ-BDY-2015-27)，3组受试者均自愿签署知情同意书。

2 结果

2.1 3组受试者临床资料比较 3组受试者性别、年龄、高血压、糖尿病比较差异均无统计学意义(P值均>0.05)，乙型肝炎组与肝癌组患者HBV DNA病毒载量比较差异无统计学意义[(4.68±1.54)log IU/ml vs(4.39±1.20)log IU/ml,P=0.119]，乙型肝炎组与肝癌组肝功能指标AST以及ALT显著高于对照组(P值均<0.05)，且肝癌组AST、ALT显著高于乙型肝炎组(P值均<0.05)(表1)。

2.2 TLR4基因型及等位基因分布与肝癌关系 经Hardy-Weinberg遗传平衡定律检验，各组的观察数与预期数比较，差异均无统计学意义(P值均>0.05)，表明各基因频率符合遗传平衡，具有群体代表性。3组受试者TLR4 D299G位点以及TLR4 A896G位点基因型及等位基因分布差异均无统计学意义(P值均>0.05)；而3组受试者TLR4 T399I位点基因型比较差异有统计学意义(P<0.05)，肝癌组T等位基因频率明显高于乙型肝炎组及对照组(P<0.05)，其中乙型肝炎组与对照组比较χ2=4.090、P=0.043，肝癌组与对照组比较χ2=14.933、P<0.001，肝癌组与乙型肝炎组比较χ2=4.091、P=0.043(表2)。非条件logistic回归模型显示，TLR4 T399I基因型及等位基因进入回归模型(P<0.05)，TLR4 T399I CC基因型OR[95%可信区间(95%CI)]为1.682(1.109～2.243)，P=0.027、TLR4 T399I TT基因型OR(95%CI)为2.103(1.347～2.896)，P<0.001；TLR4 T399I T等位基因OR(95% CI)为1.872(1.192～2.374)，P=0.002。

2.3 TLR4基因型对肝癌患者术后复发的影响 TLR4 D299G位点以及TLR4 A896G位点不同基因型肝癌患者术后无复发生存情况无明显差异(χ2=0.022、0.471，P值均>0.05)；TLR4 T399I位点CC基因型肝癌患者术后无复发生存情况明显优于CT+TT基因型(χ2=6.781，P<0.05)(图1～3)。

表1 3组受试者临床资料比较

表2 TLR4基因型、等位基因与肝癌的关系[(例)%]

3 讨论

肿瘤是一种多基因疾病，基因的变异、缺失以及畸形是导致肿瘤发生发展的重要因素，肿瘤的遗传易感性是由于不同基因、不同多态相关的组合效应所构成[8]。肝癌是全球范围内最具挑战的健康问题之一，我国原发性肝癌发病最为常见的原因为HBV感染[9]。对于HBV相关原发性肝癌患者的临床治疗，目前主要以手术治疗为主[10]，肝叶切除术一直是患者首选治疗方式[11-12]。但是由于患者术后高复发率以及高转移率，手术切除术后患者临床预后仍不理想。除了各种外部因素的影响，近年来学者[13-14]提出，遗传因素也对患者术后复发、转移有重要影响。

TLRs家族是一类天然免疫识别受体，主要在树突状细胞、巨噬细胞以及单核细胞等细胞膜上表达，是介导特异性免疫反应的跨膜模式识别分子受体家族，可介导机体的天然免疫，同时也可提供刺激分析和诱导T淋巴细胞分化的细胞因子，帮助机体建立获得性免疫[15-16]。TLR4是TLRs家族中独特的一员，在机体固有免疫起始反应中具有举足轻重的作用，研究[17-18]显示，TLR4在肝癌组织中高表达，且新的证据表明TLR4与肿瘤的发生以及肿瘤进展有关，TLR4激活可导致免疫反应的活化，继而促进肿瘤的发生发展。有研究[19-20]报道，TLR4基因多态性与结肠癌、胃癌等多种肿瘤的易感性有关，本研究探讨分析TLR4基因多态性与HBV相关原发性肝癌易感性之间的关系以及对患者预后的影响。

本研究结果显示，3组受试者TLR4 D299G位点以及TLR4 A896G位点基因型及等位基因分布差异均无统计学意义(P值均>0.05)；而3组受试者TLR4 T399I位点基因型比较差异有统计学意义(P<0.05)，肝癌组T等位基因频率明显高于乙型肝炎组及对照组(P<0.05)。提示TLR4 T399I位点基因突变与HBV相关原发性肝癌发生密切相关，该位点T基因的携带可能是肝癌易感因素之一，T等位基因肝癌发生风险是C等位基因的1.872倍，与既往研究[21]结果相似，认为TLR4 T399I位点T等位基因可能促进肿瘤组织中TLR4的过度激活，促进IL-1α以及TNFα表达的升高，从而促进肿瘤的发生发展。有研究[23]报道，肝炎病毒感染所引发的炎症反应可激活TLR4信号途径，诱导IL-6等细胞因子的分泌，促使肿瘤细胞对细胞毒性T淋巴细胞的攻击产生抵抗作用，促使肿瘤细胞逃避免疫攻击，但肿瘤最终的发生取决于个人对肿瘤的易感性。

此外，本研究分析TLR4基因多态性与HBV相关原发性肝癌患者术后复发情况的影响，结果显示，TLR4 D299G位点以及TLR4 A896G位点不同基因型肝癌患者术后无复发生存情况无明显差异(P>0.05)；TLR4 T399I位点CC基因型肝癌患者术后无复发生存情况明显优于CT+TT基因型(P<0.05)。提示TLR4 T399I位点基因多态性与肝癌患者临床预后密切相关，其中CT+TT患者术后复发率更高，T基因的携带可能导致患者预后更差，而关于其影响机制，目前尚未见相关研究报道，仍需进一步深入研究分析，考虑与肿瘤细胞侵袭转移能力、机体免疫以及基因对肿瘤耐药影响等因素有关[23]。

综上所述，TLR4 T399I位点基因多态性与HBV相关原发性肝癌易感性密切相关，该位点T基因携带可能是肿瘤发生以及预后不良的重要因素。