基于Toll样受体4/核因子-κB信号通路研究莪术醇抗肝纤维化的分子机制

郑 洋，王嘉孺，刘露露，王佳慧，赵铁建

1 广西中医药大学赛恩斯新医药学院医学系，南宁 530021；2 广东医科大学护理学院，广东 东莞 523000；3 广西中医药大学第一附属医院教学部，南宁 530022；4 广西中医药大学基础医学院 生理教研室，南宁 530021

肝纤维化是慢性或反复性肝损伤的最终共同途径，以细胞外基质(ECM)蛋白主要是胶原蛋白的过度积累为特征。晚期慢性纤维化常发展成为肝硬化，且伴有结构丧失和功能衰竭的并发症发生[1-3]。肝窦内皮细胞(liver sinusoidal endothelial cells, LSEC)构成了肝血窦的血管壁, 是肝内非实质细胞的主要类型。已分化的LSEC电镜下有其特征性的窗孔结构, 且窗孔内皮下缺乏完整的基膜，这种特征性结构在肝实质细胞与血液物质交换中起着关键作用[4]。在肝纤维化发生早期，LSEC就会出现去窗孔化，内皮下基底膜形成，这种现象被称为肝窦毛细血管化，是肝纤维化形成的一个重要病理学改变[5-7]。

猪通常被称作“六畜之首”。考古学家发现，早在近万年前，人类就开始驯化并饲养野猪了。野猪性格凶猛，发起怒来连“兽中之王”老虎也要怕它三分。而被驯化的家猪，不但一改野猪的习性，而且在外貌上也发生了很大的变化。猪浑身都是宝，不仅是重要的肉食来源，还是制作皮革的原料，就连粪便也是上等的农肥呢。

莪木醇为广西道地药材莪术的主要活性成分，具有抗纤维化作用，但具体作用机制仍不清楚。

Toll样受体(TLR)是一类天然免疫受体，能引发一系列信号转导，导致炎性介质的释放，在天然免疫防御中起重要作用。其中TLR4是人类发现的第一个TLR相关蛋白，革兰阴性菌细胞壁的主要成分脂多糖(LPS)是其主要配体[8]。近年研究[9]发现，TLR4表达于各类肝脏细胞中，可以调节肝脏细胞的天然免疫反应，在肝脏疾病的发生及发展过程中发挥重要作用。LPS/TLR4信号通路在肝星状细胞(HSC)和LSEC活化可以促进肝纤维化的形成[10]，通过TLR4/MyD88/NF-κB、MARK两条重要的信号通路直接增强肝脏的炎症反应，影响HSC和LSEC等自身细胞活化、增殖、凋亡、胶原的分泌合成及促纤维化细胞因子分泌，促进肝纤维化形成。TLR4信号通路上的NF-κB是增强肝脏炎症反应、参与调控LSEC增殖和凋亡、促进胶原合成及分泌的一个重要炎症转录因子，可触发炎性细胞因子大量释放，如IL-6、TNFα、IL-8等[11]，增强肝脏的炎症反应形成“炎性瀑布”，最终导致肝纤维化形成。本研究以LSEC的TLR4/NF-κB信号通路为研究对象，通过免疫印迹和实时荧光定量PCR(RT-PCR)检测该信号通路上关键分子TLR4和NF-κB的表达水平，利用免疫荧光检测NF-κB的表达及入核情况。

1 材料与方法

1.1 材料

治疗后，平衡针灸治疗组患者的生活质量评分为（78.12±8.12）分，常规针灸治疗组患者的生活质量评分为（65.12±7.56）分，组间数据比较，差异具有统计学意义（P＜0.05）。详见表2。

1.1.2 药物与试剂 莪术醇(阿拉丁C114054-20 mg)、HE试剂盒(北京索莱宝科技有限公司，G1120)、Msson试剂盒(北京索莱宝科技有限公司，G1340)、LPS(Sigma L2880)、小鼠抗大鼠TLR4一抗(Santa Cruz，J1016)、兔多抗P65(65 kD)(武汉三鹰生物技术有限公司，10745-1-AP)、兔单抗P-P65(65 kD)(CST，3033)、DAPI(碧云天，C1002)。

植物基质沙垫是江苏绿东坡环境工程有限公司生产的一种采用高密度、耐用、防腐蚀特殊性聚酯纤维和特殊工艺编织成的双层或多层编织物，现场铺设在受保护的坡面上，按顺序注入各种混合基质，使坡面受到保护，并可迅速恢复原有植被，达到自然状态。植物基质沙垫无骨料，无钢筋，水上水下整体施工，无需围堰和船舶拖排，施工简易，安全可靠，整体性强，防护性好，抗冲刷（5～6m/s），抗水压（30t/m2）、防淘蚀，适用性强，生态美观。植物基质沙垫根据各种工况要求，可设计成反滤型、无滤型、植草型、抗浪型等多种类型，可广泛应用于堤岸防护、水资源保护和水土保持工程中。

1.1.3 主要仪器 低速离心机(Eppendorf，5702R)、水平摇床(江苏海门其林贝尔仪器制造有限公司，TS-1)、组织切片机(美国WPI公司，NVSLM1)、RT-PCR仪(ABI QuantStudio 6)、PCR仪(东胜创新生物科技有限公司，EDC-810)。

据表1所示，从调查覆盖的地理区域来说，本调查所收集到的招聘信息涵盖了全国大部分省（直辖市、自治区），获得的招聘信息是比较充分的。

2.2 TLR4和NF-κB mRNA表达水平 各组间TLR4 mRNA和NF-κB mRNA比较差异均有统计学意义(P值均<0.001)。与阳性对照组比较，莪术醇干预组和PDTC组TLR4 mRNA、NF-κB mRNA的表达水平均明显降低(P值均<0.05)。莪术醇干预组和PDTC组TLR4 mRNA、NF-κB mRNA的表达水平比较差异无统计学意义(P值均>0.05)(表3)。

1.2.3 RT-PCR法检测TLR4和NF-κB mRNA 在细胞中加入1 ml Trizol试剂，用枪吹打混匀，移至无RNase的1.5 ml EP管中，裂解10 min，加入200 μl氯仿，剧烈颠倒混匀数次，室温放置5 min，4 ℃以14 256×g离心15 min。转移上层水相(约400 μl)于另一新1.5 ml EP管中，加入400 μl异丙醇，混匀后室温静置10 min。4 ℃以14 256×g离心10 min可见RNA沉淀。弃上清，加入无RNase的75%乙醇1 ml，涡旋混匀后，4 ℃以9900×g离心5 min。弃上清，干燥RNA沉淀5～10 min，将沉淀溶于20 μl DEPC水中。在cDNA反应体系中将RNA转录成cDNA，反应条件为25 ℃ 5 min，50 ℃ 15 min，85 ℃ 5 min，4 ℃ 10 min，将得到的cDNA放入RT-PCR反应体系中，反应条件为50 ℃ 2 min，95℃ 10 min；95 ℃ 30 s，60 ℃ 30 s，40个循环。取PCR产物在琼脂糖凝胶电泳，在凝胶成像分析系统上成相，利用分析系统进行灰度扫描，得到光密度值(IOD)，以GAPDH为内对照，TLR4和P65NF-κB上下游引物及长度见表1。

1.2.4 免疫印迹检测TLR4和NF-κB 提取细胞总蛋白，进行SDS-PAGE电泳分离、转膜。用含5% 脱脂奶粉的TBST(封闭液)浸泡PVDF膜，室温摇床封闭2 h。用封闭液稀释相应的一抗，用封闭液稀释相应的HRP标记二抗，使PVDF膜浸泡于二抗孵育液中，37℃摇床孵育2 h。洗去多余的二抗，通过ECL显色系统显色，用BandScan分析胶片灰度值。

1.1.1 实验动物 清洁级KM小鼠50只，周龄2周，体质量12～16 g，购于湖南斯莱克景达实验动物有限公司，合格证号[SCXK(湘)2016-0002]，使用许可证号[SYXK(桂)2015-0001]。所有小鼠适应性饲养1周后进行实验。

表1 引物序列表

2.3 TLR4和NF-κB蛋白的表达水平 各组间TLR4和NF-κB比较差异均有统计学意义(P值均<0.001)。莪术醇干预组TLR4表达水平明显低于阳性对照组和PDTC组(P值均<0.05)；莪术醇干预组和PDTC组磷酸化NF-κB表达水平明显低于阳性对照组(P值均<0.05)(图2，表4)。

1.3 动物伦理学审查 本研究方案经由广西中医药大学实验动物伦理委员会审批，符合实验室动物管理与使用准则。

1.2 方法

1.2.1 动物和细胞实验分组 50只小鼠按随机数字表随机分为3组：模型组(n=19)、莪术醇组(n=21)和空白组(n=10)，除去建模过程中死亡的小鼠，最后每组各10只。模型组和莪术醇组给予40%CCl4花生油混合液(剂量2 μl/g)，腹腔注射，每周2次，连续8周，空白组给予等量的花生油。在造模结束后，莪术醇组给予30 mg/kg莪术醇灌胃处理，给药容积为1 ml/100 g，其余2组给予等量的生理盐水。细胞共分为4组，取处于对数生长期，生长状态良好的原代大鼠LSEC，用内皮细胞完全培养基调整细胞密度到5×104个/ml，接种96孔板，每孔100 μl细胞悬液，同时设空白孔，37 ℃培养过夜(在细胞孔周围孔内加入100 μl无菌PBS)。2%DMEM培养基处理空白对照组；LPS阳性对照组用5 μg/ml LPS处理3 h；莪术醇干预组用45 μg/ml莪术醇预处理30 min后再用5 μg/ml LPS处理3 h；PDTC(NF-κB特异性抑制剂)组用25 μg/ml PDTC预处理30 min后再用5 μg/ml LPS处理3 h，每组设3个复孔。

2 结果

2.1 肝组织病理检查结果 各组小鼠肝组织HE染色结果(图1)显示，空白组：肝细胞以汇管区为中心呈现放射状排列，未见明显异常病理学改变，肝窦清晰；模型组：肝小叶之间分界不清，存在假小叶，肝细胞排列不规则，有空泡样的改变，大量胶原组织产生；莪术醇组：病变情况较模型组有所改善。Masson染色结果(图1)显示，空白组：肝组织内有少量胶原沉积；模型组：有大量胶原纤维沉积在肝小叶和肝窦内；莪术醇组：肝组织内胶原沉积较模型组改善。

依据肝纤维化病理Ishak评分标准[13]对HE图片进行分析，正常为0分；汇管区有纤维化为1分；汇管区有纤维间隔形成为2分；汇管区大面积纤维化为3分；汇管区有纤维化伴明显的汇管-中央桥接纤维化为4分；明显的汇管-中央桥接纤维化伴有结节为5分；有肝硬化形成为6分。模型组Ishak评分显著高于空白组(P<0.05)，莪术醇组Ishak评分显著低于模型组(P<0.05)；模型组胶原表达水平显著高于空白组(P<0.05)，莪术醇组胶原表达显著低于模型组(P<0.05)(表2)。

1.2.2 LSEC分离培养 LSEC的分离参照文献[12]，采用肝脏胶原酶灌注结合Percoll密度梯度沉降法及细胞选择性贴壁法。将Percoll密度梯度离心分离所得的LSEC，放到适宜的培养基(10%胎牛血清)，饱和湿度，5%CO2中培养。细胞生长成铺路石样形态，待细胞生长达约80%融合度时，用0.25%的胰蛋白酶和0.02%的乙二胺四乙酸(EDTA)消化收集细胞。

表2 各组Ishak评分以及胶原表达情况

表3 TLR4和NF-κB基因mRNA表达情况

1.2.5 免疫荧光检测NF-κB表达及入核情况 每组细胞用PBS洗3次，每次3 min，然后用4%多聚甲醛溶液固定15 min，PBS洗涤细胞3次。用含山羊血清的0.5%Triton X-100孵育细胞，与荧光标记羊抗兔IgG抗体共同孵育。使用荧光倒置显微镜进行可视化。

2.4 莪术醇可以减少NF-κB入核及表达 阳性对照组较空白对照组NF-κB表达水平增加，莪术醇干预组较阳性对照组表达水平有所下降，PDTC组较阳性对照组表达水平下降(图3)。

本文通过对小说女主人公安娜·卡列尼娜分析和把握，分别从这一人物的正面形象和负面形象出发，力图能够展现出一个鲜活饱满的魅力女性形象，但不得不承认的一点是，安娜形象的分析并不仅仅是局限于以上的几点内容，而应该是更加丰富的、更加复杂的。作为一个男性作家托尔斯泰以他独特的视角和细腻的笔触，将自己独特的女性观融入小说创作，塑造了安娜·卡列尼娜这样一个复杂而迷人的女性形象。

3 讨论

肝纤维化是慢性肝炎进一步发展的重要阶段，是ECM大量沉积的一种病理生理过程[14]。众所周知，肝纤维化最终会导致肝硬化和肝衰竭。研究[15]表明肝纤维化可以被逆转。笔者早期研究[16]表明，莪术醇具有抗纤维化作用。现有数据表明，莪术醇可以恢复肝窦毛细血管化。LSEC构成了肝血窦的血管壁，是肝内非实质细胞的主要群体，约占肝非实质细胞的50%。已分化的LSEC电镜下可见其特征性的窗孔结构，且窗孔内皮下缺乏完整的基膜，窗孔占据总表面积的6%～8%，这种多孔性结构在肝实质细胞与血液物质交换中起着关键作用[17-18]。肝纤维化或体外培养的LSEC功能及形态发生重要改变，一是LSEC的失窗孔化，表现为窗孔数目的减少和孔径变小，甚至消失；二是肝窦内皮下形成高密度基底膜，这一现象于1963年由Schaffner等[19]发现并命名为肝窦毛细血管化。LSEC的失窗孔导致其通透性降低，各种代谢产物不容易进入血循环，加重肝病理性损伤；同时减弱了肝细胞和血液之间氧及营养物质的交换，最终导致肝细胞损伤和肝窦塌陷，而肝窦的塌陷会导致肝内血管网减少，在门静脉高压的形成过程中起重要作用[20-21]。

表4 TLR4和NF-κB蛋白表达水平

LSEC不仅是构成肝窦壁的主要成分，并且可以合成和分泌NO，调节肝内血管舒张和收缩，对肝窦血流的调节起重要作用。NO具有强大的血管扩张作用，它以旁分泌形式直接刺激可溶性鸟苷酸环化酶，使环鸟苷酸增多，从而引起Ca2+降低和血管扩张。NO还可以通过抑制HSC中α-平滑肌肌动蛋白(α-SMA)引起HSC舒张[22-23]。eNOS-NO-cGMP 信号通路是调控LSEC窗孔形成的重要通路[24]。当NF-κB信号通路活化时，IκB激酶被激活，使其磷酸化进而泛素化降解NF-κB抑制蛋白IκBα，胞质中IκBα水平下降，使NF-κB P65亚基从抑制状态变为活化状态入核，P65的入核能激活多种炎症因子的表达，同时能调节iNOS基因的转录，导致肝脏微循环的紊乱[25-26]。TLR4/NF-κB信号通路是调控机体炎症反应的经典通路之一，TLR4是LPS的主要受体，参与了LPS诱导的炎症反应和氧化损伤[27]。目前研究[28-29]表明, TLR4介导的NF-κB信号通路在肝纤维化的发展中发挥了重要作用, HSC在静止和活化状态下均表达TLR4, 而活化状态下的HSC则表达完整的TLR4/NF-κB信号通路在肝纤维化的发展中发挥了重要作用。Shi等[30]研究表明, 当TLR4与LPS结合后, 通过MyD88-NF-κB通路激活HSC, 活化的HSC分泌TGFβ等重要纤维化因子, 同时又分化成为肌成纤维细胞并产生大量的ECM累积在肝组织中, 最终形成肝纤维化。

当然，女贪官腐败还有诸多其他动机，例如侥幸心理、补偿心理、攀比心理等。笔者认为，侥幸心理只是上述投机心理的别样称呼，基于不平衡心理而生的补偿心理只是一种自我报偿心理，仍不出“报偿”的范畴，而攀比心理看似 “趋寡”实为“追风”，只是对“从众”的表面偏离，仍属从众心理的范畴，故于此不再论述。

本实验以小鼠和LSEC为研究对象，在动物层面证实莪术醇可以改善肝纤维化的病理改变；在细胞层面发现莪术醇可以明显抑制TLR4和NF-κB的表达，对NF-κB的入核也有明显的抑制。由此推测莪术醇可能是通过抑制TLR4/NF-κB信号通路发挥抗肝纤维化的作用。具体的分子机制有待进一步的研究，为莪术醇临床治疗肝纤维化提供科学依据。