莱芜黑猪肉中烟酸含量的测定

曹 峰 耿冬青 周志杰

济南市第二食品药品检验检测中心 山东济南 271100

莱芜黑猪(莱芜猪)是我国优良的地方品种，2006年被农业部列为国家级畜禽遗传资源保护品种，具有肉质细嫩多汁、香味浓郁等优良特性[1]。莱芜黑猪肉营养丰富，肌内脂肪含量、肌肉鲜味氨基酸、必需氨基酸等均高于普通猪肉[2]，此外黑猪肉中的维生素含量较高，尤以烟酸较多。烟酸(Nicotinic acid)也称维生素B3、尼克酸，是人体必需的13种维生素之一。烟酸在人体内可转化为烟酰胺，参与体内脂质代谢，组织呼吸的氧化过程[3]。烟酸还具有抑制动脉粥样硬化[4]，保护人脐内皮细胞，维护血管结构及功能等作用[5]。人体若缺乏烟酸，可产生糙皮病。此外，烟酸常添加在猪肉等肉类产品中，以保持肉的色泽鲜艳，然而摄入过量的烟酸会引起充血症，如脸红，皮肤骚痒，头痛等症状[6]。因此，准确快速测定烟酸含量对提高莱芜黑猪肉的品质及确保食品安全具有重要意义。

目前烟酸的检测方法有高效液相色谱法[7]、微生物法[8]、紫外分光光度法[9]、毛细管电泳法[10]，超临界流体色谱法[11]等，其中高效液相色谱法是较常用的方法，具有灵敏度高、重现性好等优点。测定食品中烟酸的前处理方法多采用酸水解法[3,6]，由于黑猪肉水解后将产生大量的水溶性蛋白，这些蛋白进入色谱柱后，很难被洗脱下来，不但影响分析效果，还会缩短色谱柱的使用寿命[12]。针对此问题，本文参照相关研究[13]并加以改进，采用20%甲醇水溶液作为提取液，经超声提取，较好地解决了这一问题，大大降低了对色谱柱的损害，并对高效液相色谱法进行了改进优化，可以简单、快速、精确测定莱芜黑猪肉中的烟酸含量。

1 材料与方法

1.1 实验仪器与试剂

1.1.1 实验仪器

Ultimate3000高效液相色谱仪(配紫外/可见光检测器)，美国赛默飞世尔科技有限公司；

TU-1901紫外可见分光光度计，北京普析通用仪器股份有限公司；

KQ-800KED高功率数控超声波清洗器，昆山市超声波仪器有限公司；

2-16KL高速冷冻离心机，德国SIGMA公司。

1.1.2 实验试剂

烟酸标准物质(质量分数≥99%)，德国Dr.Ehrenstorfer公司；

甲醇(色谱纯)，默克股份两合公司；

磷酸二氢钾(优级纯)，国药集团化学试剂有限公司。

1.2 色谱条件

色谱柱：Kromasil C18柱(150×4.6mm，5.0μm)。

流动相：甲醇-0.05mol/L磷酸二氢钾缓冲液(5∶95，V/V)。

流速：1mL/min。

柱温：30℃。

紫外检测器波长：261nm，进样量20μL。

1.3 样品处理

称取20g莱芜黑猪肉(瘦肉)样品，放于均质器中并加入20%甲醇溶液20mL，研磨成浆并混合均匀，然后称取2g(精确至0.001g)匀浆试样至50mL塑料离心管中，加入20mL20%甲醇，涡旋混匀后放入超声波清洗器中超声提取60min，再以6 000r/min离心15min，将全部上清液移入容量瓶中，用20%甲醇定容至50mL，经0.22μm有机相滤膜过滤后待测。

2 结果与讨论

2.1 色谱条件的确定

2.1.1 紫外检测器波长的选择

将烟酸标准溶液用紫外分光光度计进行光谱扫描，以确定烟酸的最大吸收波长，结果见图1所示。

扫描光谱图可以显示烟酸在波长261nm处有最大吸收，与国标方法[14]相同，为保证该方法的灵敏度及稳定性，选择261nm作为检测波长。

2.1.2 流动相的选择

本研究在流动相组成及比例不同的条件下，根据保留时间与色谱峰分离情况等，来确定适合的流动相组成及比例。参照相关文献[14～19]，本研究同时验证了甲醇-0.05mol/L磷酸二氢钾缓冲液、甲醇-异丙醇-庚烷磺酸钠、甲醇-0.004mol/L庚烷磺酸钠-冰醋酸、乙腈-0.02mol/L磷酸二氢钾缓冲液4种不同流动相体系，结果表明以甲醇-0.05mol/L磷酸二氢钾缓冲液与乙腈-0.02mol/L磷酸二氢钾缓冲液为流动相时目标峰与杂质峰能很好分离，由于甲醇毒性较小，因此选用甲醇-0.05mol/L磷酸二氢钾缓冲液作为流动相。

将甲醇-0.05mol/L磷酸二氢钾缓冲液分别在体积比为5∶95、10∶90及15∶85的条件下对烟酸标准品进行检测，结果发现在体积比为5∶95时烟酸出峰时间为3min左右，烟酸色谱峰峰形好，且能与杂质峰完全分离，甲醇的体积比提高到10%及15%后，烟酸色谱峰的保留时间缩短，但与杂质峰无法完全分离，因此本研究选择甲醇与0.05mol/L磷酸二氢钾缓冲液的比例为5∶95(V/V)。

2.1.3 色谱柱柱温的确定

色谱柱的分离效果受柱温影响较为显著，温度升高，柱压下降，保留时间缩短。由于烟酸比较耐热[3]，是理化性质最稳定的一种维生素[19]，为提高检测精密度，缩短分析时间，柱温选择30℃。

2.1.4 烟酸标准物质及莱芜黑猪肉色谱图

根据以上实验分析确定的色谱条件，烟酸标准物质溶液及莱芜黑猪肉样品色谱图见图2、图3。

2.2 烟酸的线性和检出限

将烟酸标准物质储备液逐级稀释，配制成6个不同浓度标准品溶液并在优化的色谱条件进行测定，得到烟酸的标准曲线回归方程为：Y=37 900X+6 550(Y，峰面积；X，浓度)，相关系数R=0.9998，曲线的RSD为1.67%，结果表明烟酸在1.0～25.0mg/L范围内浓度和峰面积线性关系良好，在此条件下烟酸的检出限(以信噪比为3∶1时烟酸标准物质溶液的浓度为本方法检出限)为2.0×10-4g/kg，标准曲线见图4。

2.3 精密度实验

莱芜黑猪肉样品按1.3方法处理后，在优化的色谱条件下对黑猪肉样品平行测定6次，计算样品的标准偏差及相对标准偏差，结果见表1。

表1 精密度实验结果(n=6)

从表1可以看出，连续6次平行测定的莱芜黑猪肉样品中烟酸含量，其相对标准偏差(RSD)为0.62%，表明该方法精密度良好，满足要求。

2.4 样品加标回收率的测定

称取适量黑猪肉样品，分别加入0.50、1.00、5.00、10.00、20.00mg/L的烟酸标准物质，依照1.3所述将样品处理，测定6次，结果见表2。

表2 加标回收结果(n=6)

表中结果显示，在1.2的测试条件下黑猪肉中烟酸的加标回收率为96.5%～103.8%，平均加标回收率为98.4%，回收率的RSD为2.76%，测定结果准确可靠。

3 结论

本方法以甲醇-0.05mol/L磷酸二氢钾缓冲液(5∶95，V/V)为流动相，采用紫外检测器，波长为261nm，烟酸在1.0～25.0mg/L范围内有良好的线性关系(R=0.9998)，精密度实验表明其相对标准偏差为0.62%(n=6)，平均加标回收率为98.4%，检出限为2.0×10-4g/kg，莱芜黑猪肉样品中烟酸的平均含量为6.21mg/100g，结果显示该方法可准确快速测定莱芜黑猪肉等肉品中的烟酸含量。