松郁安神方对肝郁证失眠大鼠机体褪黑素水平的影响

张一帆 李星 张瑜

摘要 目的：观察松郁安神方对肝郁证失眠大鼠机体褪黑素水平的影响。方法：将40只大鼠随机分成正常对照组、模型组及松郁安神方低、中、高剂量组，采用慢性夹尾刺激和腹腔注射对氯苯丙氨酸（PCPA）复合因子造模法建立肝郁证失眠大鼠模型，给药后测定肝郁证失眠大鼠机体的脑脊液、血清、脑组织（下丘脑、海马）褪黑素（MT）水平的变化。结果：肝郁证失眠大鼠机体脑脊液、血清、脑组织（下丘脑、海马）的MT水平均显著低于正常组（P<0.05），松郁安神方低剂量组脑脊液、血清、海马的MT水平及松郁安神方中剂量组血清的MT水平显著高于模型组（P<0.05），而松郁安神方低剂量组血清的MT水平与松郁安神方中剂量组比较无显著差异（P>0.05）。结论：松郁安神方对肝郁证失眠大鼠具有促睡眠作用，其作用机制可能是通过提高机体褪黑素水平而实现。

关键词 松郁安神方;失眠;肝郁证;褪黑素

Abstract Objective：To observe the effect of Song Yu An Shen Fang on levels of melatonin in rats with insomnia with syndrome of stagnation of liver qi.Methods：A total of 40 rats were randomly divided into normal control group，model group，low，medium and high dose group of Song Yu An Shen Fang group.The insomnia rat model of liver depression syndrome was established by chronic tail clamping stimulation and intraperitoneal injection of PCPA compound factor.The changes of melatonin（MT）in cerebrospinal fluid，serum and brain tissue（hypothalamus and hippocampus）of insomnia rats with stagnation of liver qi syndrome were measured after administration.Results：The MT level of cerebrospinal fluid，serum and brain tissue（hypothalamus and hippocampus）in the insomnia rats with stagnation of liver qi syndrome was significantly lower than that in the normal group（P<0.05）.The MT levels of CSF，serum and hippocampus in the low dose group and the middle dose group were significantly higher than those in the model group（P<0.05）.There was no significant difference in MT level between the low dose group and the middle dose group（P>0.05），Conclusion：The effect of Song Yu An Shen Fang on promoting sleep of insomnia with syndrome of stagnation of liver qi may be achieved by increasing the level of melatonin.

Keywords Song Yu An Shen Fang; Insomnia; Syndrome of stagnation of liver qi; Melatonin

中圖分类号：R256.23文献标识码：Adoi：10.3969/j.issn.2095-7130.2020.03.074

中医在治疗失眠上有独有的优势，其病因病机虽复杂，但其发病与个体的体质和性格特征密切相关，临床上多数失眠的反复发作与异常情绪常相互伴随，并且一些针对失眠的证型和方药研究[1，2]显示从肝郁论治失眠具有较好疗效。

黄俊山教授结合多年失眠的临床经验，创制了松郁安神方（药用：甘松、郁金、玫瑰花、生龙骨、珍珠母、夜交藤、丹参、酸枣仁）主要针对肝郁证而设，功在疏肝解郁、安神定志，经临床证实疗效确切，但作用机制需要进一步明确。本文通过观察松郁安神方对肝郁证失眠大鼠在脑脊液、血清、脑组织（下丘脑、海马）中褪黑素（MT）水平的变化，探讨松郁安神方影响睡眠的药效作用机制。

1 材料与方法

1.1 动物与分组 健康雄性SD大鼠，8周龄，体质量180～200 g，购于上海斯莱克实验动物有限责任公司[动物合格证编号：20170005009597，许可证号码：SCXK（沪）2017-0005]。将40只大鼠适应性喂养后随机分为正常对照组、模型组、松郁安神方低剂量组、松郁安神方中剂量组、松郁安神方高剂量组，每组8只。

1.2 实验药物的制备 松郁安神方的组成及用量：成人（按60 kg体质量计算）用量：甘松10 g，郁金15 g，玫瑰花10 g，生龙骨（先煎）30 g，珍珠母（先煎）30 g，合欢皮15 g，丹参15 g，酸枣仁15 g，所有中药均购于福州鹭燕医药有限公司;大鼠用量为成人的6倍（按体质量计算），按传统煎药方法煎煮，浓缩，分装灭菌后4 ℃冰箱冷藏备用;临用前置于室温环境下预热（其中最终含生药浓度低剂量为0.7 g/mL、中剂量为1.4 g/mL、高剂量为2.8 g/mL）。

对氯苯丙氨酸（PCPA）的配制：将PCPA充分研磨，用弱碱性生理盐水助溶，临用时配成40 mg/mL的混悬液。

1.3 造模及干预方法 采用朱洁等[3]肝郁证失眠大鼠模型的建造方法，给予大鼠慢性夹尾刺激和PCPA腹腔注射复合因子造模法，将每组大鼠置于同一笼内，用尖端包扎纱布的止血钳分别夹大鼠尾部，令其与其他大鼠厮打，每天刺激40 min，控制刺激强度，以不破皮流血为度，连续20 d，于造模第16天起，模型组和松郁安神方低剂量组、中剂量组、高剂量组的大鼠按40 mg/100 g腹腔注射PCPA，1次/d，连续2 d;于造模第7天起，正常对照组、模型组给予生理盐水及松郁安神方各组大鼠给药以1 mL/（100 g·d）灌胃，连续14 d;造模第21 d，用10%水合氯醛以0.35 mL/100 g体质量麻醉大鼠，以备实验取材。

1.4 标本取材 实验大鼠麻醉后，头部剪毛与消毒后，剪开头部皮肤，成十字口，从蛛网膜下腔进针，取脑脊液，离心，取上清液，置于-70 ℃保存备用;取完脑脊液后，腹主动脉取血，静置两小时，离心，取上清液，分装离心管，置于-70 ℃保存备用;取血后大鼠断头，剪开头皮，用血管钳揭去颅骨和硬脑膜，剪断双侧视神经后用眼科鑷子迅速取出大鼠的整个脑组织，用0.9%氯化钠溶液冲洗干净，冰上分离出下丘脑和海马组织，置于-70 ℃保存备用。

1.5 指标检测 应用酶联免疫吸附法（ELISA）检测大鼠血清、脑脊液、脑组织（海马、下丘脑）的褪黑素（MT）的含量，具体操作严格按照试剂盒说明书。

1.6 统计学方法 采用IBM SPSS statistics V21.0统计软件进行数据处理，计量数据用均数±标准差（±s）表示，多组之间的比较采用单因素方差分析，若方差齐采用LSD检验，若方差不齐采用Tamhane′s T2检验，以P<0.05表示差异有统计学意义。

2 结果

2.1 各组大鼠一般状态比较 正常对照组，精神状态好、反应灵敏、毛发有光泽;模型组和松郁安神方各组，在第1w内，大鼠表现为易激惹、防御、抵抗和互相撕咬、尖叫明显、反应灵活、毛发欠光泽、饮食减少;在后2w内，模型组大鼠神情倦怠、易激惹、各种防御、抵抗和互相撕咬不及之前积极、尖叫声细、反应欠灵活、毛发干枯、有脱毛现象，符合肝郁证失眠模型的体征表现[3]，松郁安神方各组较模型组一般状态均有改善。

2.2 各组大鼠脑脊液、血清、脑组织MT含量比较及均值图 结果显示，肝郁证失眠大鼠机体脑脊液、血清、脑组织（下丘脑、海马）的MT水平均显著低于正常组，差异有统计学意义（P<0.05）;松郁安神方低剂量组脑脊液、血清、海马的MT水平及松郁安神方中剂量组血清的MT水平显著高于模型组，差异有统计学意义（P<0.05），而松郁安神方低剂量组血清的MT水平与松郁安神方中剂量组比较差异无统计学意义（P>0.05）。从表1、2的比较和图1均值图可知，剂量越大对肝郁证失眠机体褪黑素水平的影响越小。见表1、表2与图1。

3 讨论

随着现代社会的压力越来越大，情志不舒导致失眠占的比重日益居多，肝性喜调达恶抑郁，从肝郁论治不寐自古有之，如《辨证录·不寐门》说：“气郁既久，则肝气不舒，肝气不舒，则肝血必耗，肝血既耗，则木中之血上不能润于心”则不寐。施明等[4]认为五脏虽皆有不寐之象，但其根源不离于肝，精神情志因素是重要环节，故指出临床辨证用药当从肝论治，以治肝为中心，兼顾调理其他四脏。肝郁影响肝藏血的生理功能，李世金[5]认为睡眠的昼夜节律与肝的关系密切，睡眠有明显的生物节律性，睡眠生物节律性的调控，是通过肝藏血来完成的。

褪黑素（Melatonin，MT）：是在哺乳动物及人体松果体中分泌的主要激素，MT调节人体免疫功能、衰老等过程，褪黑素在预防皮层功能紊乱，如运动、感觉、记忆和心理损伤方面是非常有用的[6]。在褪黑素多方面调节作用中，对睡眠的调节作用显得尤为突出，其分泌呈夜高昼低的规律，夜间褪黑素水平的高低直接影响睡眠的质量;据报道[7]褪黑素对中枢神经兴奋性的抑制机制可能通过抑制一氧化氮合酶，使谷氨酸受体激活产生NO水平下降而起作用。说明MT抑制NO及MDA的升高作用，即抗自由基和抗过氧化损伤作用，可能是其发挥改善睡眠剥夺大鼠行为障碍的重要作用机制之一。脑内促睡眠系统主要包括下丘脑腹外侧视前区、大脑皮质等结构的GABA能神经元及相关递质，下丘脑视交叉上核可能是控制昼夜节律的关键部位;海马在睡眠的调节中同样起重要作用，可促进慢波睡眠，因此海马是研究睡眠一个很有意义的观察点[8]。大鼠的生活规律昼伏夜出，完全符合我们日间取材探讨褪黑素影响睡眠的节律，因此我们选择MT作为观察指标，并选取了脑脊液、血清、下丘脑、海马多部位的检测。

肝郁证失眠和MT有一定的相关性，王志丹[9]通过失眠症中医证素分布规律及其与相关神经递质、激素的关联性研究提示中医的病位证素肝与MT具有相关性，对失眠症的干预可从调肝入手。王兴凯[10]研究表明慢性应激肝郁证与MT之间存在明确的相关性。

基于中医特色，目前从肝郁证论治失眠的自拟方，如黄娜娜等[11]用自拟的清肝安神汤及张丽[12]用自拟的疏肝解郁汤治疗肝郁证失眠，疗效明显;松郁安神方是福建省名老中医黄俊山教授根据多年失眠临证经验总结的针对肝郁证失眠的有效方剂，功用疏肝解郁，安神定志，该方重用甘松、郁金、玫瑰花疏肝解郁、调畅气血为君，甘松现代药理研究证实既抗焦虑又抗抑郁，改善情绪[13];生龙骨和珍珠母重镇安神为臣，以解除肝郁气滞，郁而化火，冲扰心神，心神不能镇慑;佐以酸枣仁养心安神、合欢皮解郁安神、丹参宁心安神，以缓解气郁化火，日久伤阴，阴虚火旺，冲扰肝魂，扰犯心经;该方重在疏肝解郁，兼顾重镇安神和宁心安神，临床疗效确切，其药效学机制需进一步阐明。

本研究结果显示：肝郁证失眠大鼠机体脑脊液、血清、脑组织（下丘脑、海马）的MT水平均显著低于正常组（P<0.05），验证了肝郁证失眠和MT的相关性;松郁安神方低剂量组脑脊液、血清、海马的MT水平及松郁安神方中剂量组血清的MT水平显著高于模型组（P<0.05），而松郁安神方低剂量组血清的MT水平与松郁安神方中剂量组比较无显著差异（P>0.05），提示松郁安神方低、中剂量组对肝郁证失眠机体褪黑素水平有不同程度的提高，对睡眠有一定的促进作用，松郁安神方的药效机制可能通过调节褪黑素水平来调整睡眠。

从表1、表2的比较和图1均值图可知，剂量越大对肝郁证失眠机体褪黑素水平的影响越小;这与临床用药中，不是一味用大剂量，完全符合;考虑其原因是否剂量增加到一定程度，由促進褪黑素分泌到抑制其分泌，或有可能影响到其他神经递质来拮抗。方剂的药效学机制都是多方面、多靶点的，松郁安神方的调节机制还有待进一步深入探讨，以期更好的为临床服务。

参考文献

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