阿尔茨海默病患者血清中外泌体的提取鉴定及蛋白质组学探析

刘春玲 郑海兴 孙艳

【摘要】目的 分析阿尔茨海默病（AD）患者血清外泌体的提取鉴定及蛋白质组学状况。方法 选择30例AD患者作为研究对象，取空腹静脉血制备血清标本。以Exo Quick试剂盒提取外泌体，并以铀铅双染色法处理后的组织块置于电镜下鉴定;选用TBST、PVDF开展蛋白质组学分析。结果 30例AD患者血清外泌体的直径为（92.64±23.41）nm;且所有标本的CD63检测均呈阳性。AD患者伴免疫球蛋白重链、维生素D结合蛋白及CD5抗原表达异常。结论 AD患者的血清中含有外泌体，其免疫球蛋白重链、维生素D结合蛋白及CD5抗原表达异常可为AD诊断、病情进展评估提供支持。

【关键词】阿尔茨海默病;外泌体;蛋白质组学

作为老年群体的常见病，AD以预后差、病程长为基本特征[1]。目前，AD的发病机制尚未完全明确，这一状况限制了其治疗体系的扩展。研究指出，外泌体与AD的发生发展存在密切关联[2]。因此，分析AD患者血清中外泌体的提取鉴定及蛋白质组学分析具有一定的现实意义。

1 材料与方法

1.1 仪器、试剂及研究对象

仪器：微量移液器;低温高速离心机;酶标仪;电泳槽等。试剂：BCA蛋白浓度测定试剂盒;兔抗CD63;ECL底物液;Exo Quick Exosome Precipitation Solution（以下记为Exo Quick试剂盒）等。

选择我院于2018年10月～2019年7月收治的30例AD患者为研究对象。男19例，女11例;年龄（64.7±11.6）岁。

1.2 方法

1.2.1 血清样本采集方法

于清晨采集30例AD患者的空腹静脉血5 ml，置于血清分离胶试管内。于室温条件下持续静置0.5 h后，置于4℃温度下，按照3000 r/min转速，持续离心5 min，取上层血清标本保存待检。

1.2.2 外泌体提取鉴定方法

提取方法：将血清标本置入干净试管内，向其中混入适量Exo Quick，充分混匀后，于4℃条件持续孵育0.5 h;所得混合物按照1500 r/min转速持续离心0.5 h;清除上清液后，再次按照上述转速离心处理5 min，即可获得外泌体（沉淀）。向沉淀内混入100～500 μl 1x PBS重悬液，获取外泌体溶液。

鉴定方法：于4℃条件下，以0.1 M磷酸缓冲液及2.5%浓度戊二醛固定2 h外泌体（形态：组织块）;采用大量0.1 M磷酸缓冲液漂洗经固定后的外泌体组织块，持续漂洗3次;于室温下，经0.1 M磷酸缓冲液、1%锇酸持续固定2 h;取大量0.1 M磷酸缓冲液漂洗经第二次固定处理的外泌体，漂洗次数与第一次漂洗一致;将外泌体组织块分别置于浓度为50%、70%、80%、90%、95%及100%的酒精上进行脱水处理;以812包埋剂、纯812包埋剂进行渗透处理;于60℃条件下，持续聚合48 h;按照60～80 nm标准，针对外泌体组织块进行切片;以铀铅双染色法进行染色处理，最后将其置于电镜下进行鉴定。

1.2.3 蛋白质组学分析方法

经封闭处理后，以封闭液稀释一抗，于一抗孵育液内浸入PVDF膜，置于4℃条件下持续孵育（过夜）;采用TBST洗去多余一抗;以封闭液稀释二抗（HRP标记），确认PVDF膜充分浸润于二抗孵育液内后，于37℃条件下孵育2 h;以TBST洗去多余二抗;按照1：1比例，混合过氧化物酶及增强液，于PVDF膜表面滴加适量工作液，待充分反应后，以X光胶片进行压片处理，分别以显影液、定影液显影、定影，最终获得胶片。将扫描出的胶片采用BandScan进行分析（灰度值参数）。以电泳仪完成蛋白质组学检测。

2 结 果

本研究中AD患者的外泌体鉴定结果为：平均直径（92.64±23.41）nm;30份标本的CD63抗体检测结果均呈阳性。蛋白质组学分析结果提示：外泌体组块中，免疫球蛋白重链、维生素D结合蛋白及CD5抗原表达异常。

3 讨 论

近年来，AD发病率逐渐升高[3]。明确AD的发病机制、早期诊断AD，已经成为改善AD患者预后的关键所在。

外泌体作为一种常见小膜泡，其可由多类细胞分泌。这种膜泡天然存在于乳汁、尿液等体液中。这种膜泡被证实参与肿瘤细胞的侵袭机制、免疫应答及细胞迁移等多种机制中[4]。近年来，随着临床关于这种膜泡研究的不断深入，其与AD之间的关联逐渐引起了人们的重视。外泌体可参与海马神经元突触、神经发育及再生机制。当机体星形胶质细胞、神经元分泌外泌體后，处于游离状态的外泌体可与受体细胞发生结合反应，进入细胞内，与胞内体包膜发生融合反应，对疾病相关蛋白形成一定的调控作用。基于上述作用，可初步判断：外泌体与AD的形成及发展存在一定关联。

对于患者血清中的外泌体，可用的检测方法较多，如色谱法及超速离心法等。上述方法虽然可证实血清标本中外泌体的存在，但所提取的外泌体标本，难以保持良好的生物活性及纯度水平。相比之下，Exo Quick试剂盒所采用的免疫沉淀法，则可借助沉淀反应，将存在于患者血清中的外泌体以沉淀形式提取出来，且这种方法可保障提取物具有生物活性。本研究以Exo Quick试剂盒提取并经电镜鉴定，30例AD患者的外泌体直径参数与既往研究一致。这一结果表明：这种提取方法，可为AD患者的诊断及病情评估提供一定支持。

而从AD患者外泌体组块的蛋白质组学分析结果来看，其在多种蛋白质方面存在异常表达现象。根据上述结果，可考虑将免疫球蛋白重链、维生素D结合蛋白及CD5抗原这三种蛋白纳入AD的初筛诊断、预后评估中，通过对患者上述三种蛋白表达状况的监测，判断其合并AD的风险，并以此为依据，调整AD患者的治疗方案。

综上所述，Exo Quick试剂盒可为AD血清外泌体的提取鉴定提供支持，而蛋白质组学分析则有助于更新AD的诊断方法。

参考文献

[1] 张 锐，王永祥，杜怡峰.外泌体在阿尔茨海默病发病机制和诊疗中的作用[J].医学综述，2019，25（18）：3547-3551.

[2] 王周凡.阿尔茨海默病患者血清中外泌体的提取鉴定及蛋白质组学研究[D].南华大学，2018.

[3] 陈建交，赵 斌，赵 杰，等.外泌体microRNAs在阿尔茨海默病中的潜在诊断价值[J].生理科学进展，2017，48（06）：401-408.

[4] 张丽玲.血浆神经来源的外泌体表达蛋白作为阿尔茨海默病早期诊断生物标志物的研究[D].天津医科大学，2017.