反向高效液相色谱-荧光法测定酒精饮料中吖啶的含量

兰 梅，刘路宏，王 毅，王洪涛，张 雪，彭梦露

（1.四川宜宾五粮液集团公司质量检测中心，四川宜宾 644007；2.四川宜宾五粮液股份有限公司质量管理部，四川宜宾 644007）

吖啶（Acridine）是一种由C、H 和N 元素构成的杂环化合物，产自石油精馏过程[1]，具有低毒性，对皮肤和黏膜有强烈的刺激性，可螯合进DNA 碱基对引起基因突变[2]。吖啶及其衍生物，常用作为染料和高级颜料[3]，从而广泛使用于食品包装材料生产制作和食品包装的表面着色。随着经济的发展，安全与健康日益成为人们最为关注的焦点，而传统的无机染料因其不可避免地会含有不同种类的重金属成分[4]，在一定时期内重金属含量一直是食品行业监控的重点，从而导致无机染料被食品周边行业逐渐遗弃，取而代之的是不含任何重金属成分的有机染料和有机颜料[5]，而吖啶则是有机染料和有机颜料中最为典型的代表[6]。酒精饮料是指乙醇体积分数在0.5 %以上供人饮用的饮料，主要包含各种发酵酒、蒸馏酒、配制酒及预调酒[7]。随着经济的发展，酒精饮料在餐桌上出现频率也逐步升高，深受消费者的喜爱。统计数据表明，2018 年度中国食品饮料市场酒精饮料占据96.4 %的份额[8]。因各种精美的酒精饮料包装在生产过程中不可避免地会使用吖啶类有机染料和有机颜料，加之吖啶类物质极易溶于乙醇等有机物中，从而会导致吖啶类物质污染饮料本体且长期稳定存在，目前对酒精饮料中吖啶类物质检测还缺少有效的分析方法，故无法对其进行有效的安全监测。本研究采用高效液相色谱技术，建立了一种酒精饮料中吖啶含量的分析方法。该法样品处理简单，检测灵敏度和准确度较高，检测投入较低，适合企业开展日常检测项目。

1 材料和方法

1.1 仪器与试剂

1.1.1 主要仪器

ThermoFisher 高效液相色谱仪（MultiMate 3000 标准四元系统，带二极管阵列检测器和荧光检测器，Chromeleon 7.0 数据处理软件），美国ThermoFisher公司；QUINTIX224 型电子分析天平，德国SI Analytics 公司；INTEGRAL 3型纯水机，美国Millipore公司。

1.1.2 材料与试剂

酒精饮料为采购市售的黄酒、鸡尾酒、啤酒、果酒及白酒；甲醇为色谱级，德国Merck 公司；乙酸为ACS 级试剂，北京百灵威科技有限公司；乙醇为色谱级，德国Merck 公司；实验用水为超纯水；吖啶标准物质，纯度98%，上海阿拉丁试剂有限公司。

1.2 溶液配制

1.2.1 标准品稀释液

取等体积的超纯水和乙醇混合，即为50 %v/v的乙醇水溶液。

1.2.2 标准品储存液

准确称取吖啶标准物质0.1020 g 于100 mL 容量瓶中，并加入适量甲醇，超声溶解后用甲醇定容至100 mL，摇匀，即得含吖啶1000 mg/L 的标准品储存液。

1.2.3 标准品中间溶液

取1.0 mL标准品储存液于100 mL容量瓶中，用标准品稀释液定容至100 mL，即为含吖啶10 mg/L的中间液。

1.2.4 标准曲线配制

用标准品稀释液将中间液逐级稀释，配制成浓度 为1.0 μg/L、10.0 μg/L、20.0 μg/L、50.0 μg/L、80.0 μg/L、100.0 μg/L的标准物质工作液。

1.3 试验方法

1.3.1 定性分析方法的研究

（1）准确称取吖啶标准物质（纯度为98 %）0.1020 g 于100 mL 的容量瓶中，用甲醇溶解并定容至刻度，即为1000 mg/L的吖啶溶液，将其转移至棕色试剂瓶中常温避光保存。用甲醇将1000 mg/L的吖啶标准物质稀释至100 mg/L 和1.0 mg/L,置于棕色试剂瓶内，在4 ℃环境中保存。

（2）选择美国ThermoFisher 的AcclaimTM 120-C18（4.6×250 mm，5 μm）反相色谱柱作为分离色谱柱，进样体积为20 μL，流动相流速为1.0 mL/min，柱温为35 ℃，采用等度洗脱的方法进行洗脱，分别以不同体积比的甲醇水溶液作为流动相，二极管阵列检测器开启紫外可见光灯，以190～800 nm 的扫描范围进行扫描，将100 mg/L 和1.0 mg/L 的标准物质进样试验，以确定目标化合物的最大紫外吸收波长和适宜的流动相比例。

（3）取目标化合物的最大紫外吸收波长N 作为激发波，以（N+20，650）为扫描区间，采用发射波扫描模式，将1.0 mg/L 的标准物质进样试验，可以确定最佳发射波长Em。确定Em 后，以Em 作为发射波长，以（200，Em-20）作为激发波扫描区间，采用激发波扫描模式，将1.0 mg/L 的标准物质进样试验，可以确定最佳激发波长Ex。

（4）利用荧光检测器，采用Ex 作为激发波长，Em 作为发射波长，进样量为20 μL，甲醇水为流动相，采用控制变量法，分别确定最佳的柱温、流通池温度、流动相比例等色谱条件。

1.3.2 定量分析方法

（1）检出限和定量限的确定：取1.0 mg/L 的吖啶标准物质，用甲醇稀释至合适浓度的溶液后测定其信噪比，取3 倍信噪比作为检出限（S/N=3），取10倍信噪比（S/N=10）作为定量限，计算该方法的检出限和定量限。

（2）线性相关性的研究：取100 mg/L 的吖啶标准物质用体积分数为50 %的乙醇溶液稀释至1.0 mg/L 的中间浓度，然后再用体积分数为50%的乙醇溶液稀释至0.1 μg/L、1.0 μg/L、10.0 μg/L、20.0 μg/L、50.0 μg/L、80.0 μg/L、100.0 μg/L 的工作浓度，依次进行RP-HPLC-FLD 分析，以目标物的色谱峰积分面积（Y）为纵坐标，浓度为横坐标（X），绘制标准曲线。

（3）加标回收率：分别以黄酒、鸡尾酒、啤酒、果酒和白酒阴性样品作为空白基体，配制吖啶含量为1.0 μg/L、10.0 μg/L 和100.0 μg/L 的加标样品，将加标样品和空白基体均经过0.22 μm 孔径的有机系微孔滤膜过滤后进入色谱仪进行分析，采用外标法计算目标物的加标回收率。

1.3.3 精密度试验

取100.0 mg/L的吖啶甲醇溶液，用50%vol的乙醇水溶液以及酒精饮料样品逐级稀释为10.0 μg/L，并分别对每个样品进行10 次独立的重复试验，以考察方法的精密度。

1.3.4 样品中目标化合物含量的测定

将市售不同品牌的黄酒、鸡尾酒、啤酒、果酒和白酒经0.22 μm 孔径的有机系微孔滤膜过滤后，分别进入色谱仪检测以测定其中吖啶的浓度，同时对所有样品配制浓度为1.0 μg/L 的加标样品，经微孔过滤后进入仪器分析，以作对比。

2 结果与讨论

2.1 定性分析中色谱条件的确定

2.1.1 目标化合物最大紫外可见吸收波长的确定

吖啶分子中含有一个吡啶环和两个苯环，在不同pH 值的溶液中可呈现绿色或蓝色荧光，从而吖啶吡啶具有荧光特性[6，9]。研究表明，具有荧光特性的有机物在其荧光激发光波长处均有紫外可见吸收特性。为确立吖啶的激发波长需先获取吖啶的紫外可见吸收光谱，当采用体积比为60 %的甲醇水溶液作为流动相分析吖啶标准物质时，在40 min分析时间里仅出现1 个色谱峰，对于1.0 mg/L 和100.0 mg/L 的吖啶标准品，色谱峰面积大小有异，在不同体积比的甲醇水溶液作为流动相时，该峰保留时间和峰型有变化，在甲醇体积比为80 %时峰型最佳，而对于空白对照（甲醇）在相同的保留时间内未见任何色谱峰。基本可断定此唯一色谱峰为吖啶，其在190～800 nm 范围内的紫外可见吸收光谱如图1，从图1 可见，吖啶在208.71 nm、248.15 nm和356.05 nm 处均有紫外吸收峰，其中最大吸收峰在248.15 nm处。

2.1.2 荧光波长的选择

分别用209 nm、248 nm 和356 nm 的紫外光作为激发光对吖啶进行发射光谱扫描发现，248 nm和356 nm 的紫外光均能激发出吖啶的荧光，其中波长为248 nm 的紫外光激发的荧光最为强烈，其发射光谱如图2 所示。从图2 可见，在248 nm 激发波长下，吖啶的发射光波长为光带模式，位于330～550 nm 区间，其中强度最大的发射光波长为446.68 nm。当采用447 nm 作为发射波长进行激发波长扫描时，其激发波光谱如图3 所示。从图3 可见，当采取447 nm 作为发射光时，激发光谱呈现出双峰，峰值波长分别为248.15 nm 和355.19 nm，其中248.15 nm 处荧光强度高于355.19 nm 处。从而，作为激发光248 nm 优于355 nm。有机物荧光强度受温度影响，在温度升高情况下其荧光强度会减弱，为获得强度最强荧光，流通池温度宜低不宜高，采用最低温度45 ℃作为池温。对于吖啶，荧光检测器参数确定激发光波长为248 nm，发射光波长为447 nm，流通池温度为45 ℃。经试验证明，在样品中，以上荧光检测器条件依然可用，未发现有波长漂移现象。

2.1.3 流动相的优化

吖啶生产过程中需要在甲醇中进行重结晶从而获得精品，因此采用甲醇作为有机相和标准物质的初始溶剂，而试验也证实采用甲醇作为流动相比乙腈等其他有机溶剂能获得更好的峰型和稳定性。在酒精饮料中醇类物质的含量最高可达96%，为确保酒精饮料中复杂的有机物群体不会顽固滞留于色谱柱中，故流动相中有机相比例将70%作为下限。分别采用体积分数为70%、75%、80%、85%、90 %的甲醇作为流动相，进样量为20 μL，流速为1.0 mL/min；荧光检测器激发波长为248 nm，发射波长为447 nm，流通池温度为45 ℃，柱温箱35 ℃分析100 μg/L的吖啶标准物质，其色谱峰对比图如图4 所示。从图4 可发现，当甲醇比例为70 %时，目标物出峰时间较晚且半峰宽较大，而随着甲醇比例升高，峰宽变窄，峰高也增加，但当甲醇比例为90 %时目标物出现鬼峰，当甲醇的体积比例为80%时目标化合物色谱峰高最高，故最佳流动相中甲醇的体积分数为80%，并采用等度洗脱。

2.1.4 色谱柱温度的确定

色谱柱和流动相确定后，分别考察了30 ℃、35 ℃、40 ℃和常温（不定温度）情况下的目标化合物的色谱峰图，保留时间随温度升高而缩短。当采用不定温度情况下，发现当室温波动过大时，目标物的保留时间有波动，极限情况下影响峰识别。在4 个温度条件下目标物的响应值没有太大的变化，唯有保留时间有偏差，考虑到室温平均水平和节能效果，采用35 ℃作为本方法的柱温。

2.1.5 前处理条件的选择

吖啶易溶于有机溶剂，在水中微溶，故针对酒精饮料样品首先考虑过滤后直接进样。酒精饮料中乙醇含量一般为30%vol～70%vol，有机物含量较高，宜采用适用于有机物的有机系微孔滤膜。试验中分别采用了通用型的尼龙膜和PVDF 膜，分别处理不同乙醇含量的空白样品和加标样品，经分析发现，尼龙膜和PVDF 膜对所有样品的加标回收影响不大，回收率均在95%～105%之间。因此选择通用型的尼龙膜和有机系滤膜均可，本研究最终选择PVDF膜。

2.1.6 色谱柱及色谱条件

采用色谱柱为AcclaimTM 120-C18（4.6×250 mm，5 μm）反相色谱柱；流动相为甲醇∶水（80∶20 v/v）；流速为1.0 mL/min；荧光检测器激发波长为248 nm，发射波长为447 nm，流通池温度为45 ℃；柱温箱35 ℃。当目标化合物进样量为20 pg 时，其色谱峰图如图5 所示，理论塔板数为16424，峰高为3846463 counts，峰面积为436186 counts·min，半峰宽为0.103 min，拖尾因子Asm=1.23。样品中吖啶色谱峰图如图5 所示，目标峰与附近杂峰分离度均＞2，分离效果良好。

2.2 定量分析方法的研究

2.2.1 工作液标准品溶剂的选择

吖啶纯化时需在甲醇中进行重结晶，故采用甲醇作为标准品储存液的溶剂，实验证实标准品浓度为1000 mg/L的甲醇溶液可长时间保存。本方法目标是用于酒精饮料检测，酒精饮料中乙醇含量为0.5%vol～96%vol，试验发现基体中乙醇浓度对图谱目标化合物峰图及响应影响较小，采用折中浓度作为工作液的基体，故采用体积分数为50 %的乙醇水溶液作为工作浓度标准品的稀释溶剂。

2.2.2 检出限和定量限的探究

将1.0 mg/L 的标准物质溶液用甲醇稀释至0.1 μg/L 和0.01 μg/L 分别进入液相色谱分析，发现0.01 μg/L 的标准品未见明显的色谱峰，0.1 μg/L 的标准品可见明显色谱峰，且信噪比S/N=3.62，依据检出限为3 倍信噪比（S/N=3）、定量限为10 倍信噪比（S/N=10）计算，可得本方法中吖啶的检出限为0.083 μg/L，定量限为0.275 μg/L。

2.2.3 线性关系的考察

以50%vol乙醇水溶液作为基体，配制成浓度为0.1 μg/L、1.0 μg/L、10.0 μg/L、20.0 μg/L、50.0 μg/L、80.0 μg/L、100.0 μg/L 的工作溶液，依据本研究中建立的色谱条件和预处理方法进行分析。以目标化合物的质量浓度为横坐标，色谱峰的积分面积为纵坐标，绘制标准曲线，获得的标准曲线方程为Y=43382X-2492.5，（R2=0.9999）。结果发现，当标准工作液浓度高于150.0 μg/L 时，出现柱过载现象。以上结果表明，当进样量为0.2 pg～2 μg，浓度为0.1～100.0 μg/L 时线性关系良好。同时研究过程中发现，在进样量为0.2 pg～2 μg，浓度为0.1～100.0 μg/L 时目标化合物浓度与色谱峰峰高也呈现线性关系，回归方程为Y=391744x-64297（R2=0.9999）。从而在使用本方法是可任意选择色谱峰峰高和色谱峰积分面积作为响应值。

2.2.4 加标回收率的测定

分别以黄酒、鸡尾酒、啤酒、果酒以及白酒为样品，配制高浓度（100.0 μg/L）、中浓度（10.0 μg/L）和低浓度（1.0 μg/L）加标样品，利用本研究开发的检测方法检测空白样品和加标样品中吖啶的浓度，并计算目标化合物的加标回收率，结果见表1。从表1 中可见，在5 种酒精饮料中，低浓度（1.0 μg/L）的加标回收率仅葡萄酒为47%，在50%～150%范围之外，其余在此范围内，而中浓度和高浓度的加标回收率良好，介于80%～110%之间。

表1 吖啶在5种酒精饮料中的回收率

2.2.5 精密度检测

分别对标准品工作液（浓度为10 μg/L）和加标样品（加标浓度为10 μg/L）按照选定的色谱参数进行10 次独立的检测试验，记录目标峰的峰面积和峰高，分别计算每个样品峰面积和峰高的相对标准偏差（RSD）。结果表明，色谱峰积分面积和峰高RSD(10)介于0.5～2.0 之间。试验结果表明，本方法进样方式和仪器精密度良好。

2.2.6 市售样品测定

采用本研究开发的检测方法分别对市售的18个不同品牌的酒精饮料进行了吖啶含量的检测，均未检出目标化合物，同时也同步进行了样品的加标试验，在加标样品中均可准确的检测加标物质及加标量，从而表明本方法适合进行酒精饮料产品中吖啶含量的检测。

3 结论

吖啶作为有机染料和有机颜料的重要成员，广泛用于食品包装。因其具备毒性和诱导基因突变的特性，食品经源于包装材料的吖啶污染后对人体健康存在一定的风险。本文建立了一种基于液相色谱法，利用荧光检测器测定吖啶含量的方法，适用于酒精饮料中吖啶含量的测定。本法操作简单，无需复杂的前处理，准确度和灵敏度较高，检测投入较低，适合酒精饮料生产企业开展酒精饮料中吖啶含量的日常检测。