基因编辑技术在植物育种工作中的应用

王一博 赫兆辉

摘   要：基因编辑技术可以精准定位基因组的特定位点，并通过插入、敲除及修饰特定的基因片段实现对基因的定向控制，目前正处于快速发展阶段。CRISPR/Cas9技术及单碱基编辑技术由于操作简单、应用灵活、效率高等特点被广泛应用于诸多领域，在植物遗传育种及性状改良中同样发挥着重要的作用，在农业生产中具有较好应用前景。

关键词：基因编辑技术;植物育种;应用

1   功能基因的敲除

利用 CRISPR/Cas9基因编辑技术敲除功能基因，目前在植物育种工作中尤为关键。这是由于 CRISPR/Cas9可以打破目标基因的表达，当Cas9和sgRNA切割目标形成双链断裂时，一般编辑受体中的非同源性末端接合修复的错误途径会被优先启动，在断裂的附近位置产生碱基，然后插入到缺失部位，通常是1个碱基的插入，有时也为短片段缺失。目前，多目标编辑技术的敲除原理，主要通过对不同的基因设计不同的sgRNA，将这些sgRNA表达小盒一起连接到表达载体中，并导入编辑的受体，这种技术能够对农作物的多个农艺性状进行改良。另外，多靶点编辑技术还可以在基因片段两端分别设置一个靶点，以删除目的基因片段，在作物育种方面有着较大的研究前景。

2   基因插入与替换

在植物染色体上替换或定点插入基因序列是一个很难突破的技术问题，而CRISPR/Cas9技术显著提高了这一难题的可操作性。在利用CRISPR/Cas9技术引入DNA双链断裂的同时，引入一个与断裂处相似的供體DNA片段两端序列相同的基因片段，这时同源性定向修复的方式将会有概率被编辑受体启动，而位于供体DNA上的基因片段会通过同源性定向修复重组整合到双链断裂的位置上。这种精准、高效和灵活的编辑方式，可避免由非同源末端连接修复途径造成的基因重排或缺失，从而稳定聚合多个优良性状的控制基因，解决传统育种过程中的难题，因此应用前景更为广阔[1]。尽管CRISPR/Cas9技术已经在水稻、玉米、大豆、拟南芥、烟草等植物中广泛应用，但其编辑目标通常局限于抗性基因，且效率不高。对此，科学家们发现了两种可提升植物基因精准插入效率的通用策略：一是以小麦矮缩病毒WDV为载体，提高载体的拷贝数，从而显著提升插入效率。经验证，这种策略在水稻[2]中的插入效率高达19.4%。二是利用Cas9和一对gRNA将目标序列从载体上“剪切”下来，再“粘贴”到植物基因组的靶位点上，这一策略利用双链断裂修复的非同源末端作为连接通路。目前这种通过“剪切”再“粘贴”实现靶向基因插入和替换[3]的方法已经在水稻中实现。这些策略在CRISPR/Cas9的基础上，为基因的定点插入被高效率地用于作物遗传改良提供了可能。

3   单碱基编辑

目前，单基因编辑最常用的手段是利用CRISPR/Cas9在靶位点引入突变，从而破坏靶细胞的功能。但由于其通常会产生无功能的蛋白，在植物遗传改良过程中很少应用。为了改变基因的功能，可以对单个或几个碱基进行精准编辑，形成功能获得性突变，实现作物性状的定向改良。因此，高效定向转换基因组序列是CRISPR/Cas9技术用于改良遗传育种过程中的关键所在，而单碱基编辑技术（Base Editor）恰好符合这一需求。

CRISPR/Cas9靶向编辑单个碱基的原理是将Cas9蛋白的突变体（Cas9n或dCas9）与胞嘧啶脱氨酶形成融合蛋白，被gRNA引导至靶位点，受脱氨酶的作用，靶位点附近的C（胞嘧啶）就脱氨为U（尿嘧啶），在DNA复制时可进行U-T（胸腺嘧啶）转换，从而实现精准的C-T碱基替换。据研究表明，同一编辑系统对不同靶位点有较大差异的编辑效率，具体原因有待进一步研究。此外，由于同源性定向修复效率和可操作性受限，利用Cas9介导的插入实现的单碱基替换，其应用价值与单碱基编辑技术无法比拟。

4   未来展望

虽然在植物遗传育种中，CRISPR/Cas9技术是一种新兴的操作手段，却为农作物遗传改良提供了有力的技术支撑[4]。例如，以突变基因MLO的3个复制为准确目标，可直接获得广谱、持久抗白粉病的小麦材料[5]。此外，科学家们也将CRISPR/Cas9改变成抗病毒的新型工具，通过使用Cas9和靶细胞gRNA形成了拟南芥和烟草对靶病毒的免疫[6-8]。

新技术的出现必定面临着新的挑战和机遇，与传统转基因植物相比，利用基因编辑技术构建的性状改良植物，仍存在着很多未知及不确定性。因此，随着基因编辑技术的快速发展及广泛应用，如何管理基因编辑的作物，将是一个值得深思的重要话题。

参考文献：

[ 1 ] 刘耀光，李构思，张雅玲，等.CRISPR/Cas植物基因组编辑技术研究进展[J].华南农业大学学报，2019，40（5）：38-49.

[ 2 ] Wang MG，Lu YM，Botella JR，et al.Gene targeting by ho-mology-directed repair in rice using a geminivirus-basedCRISPR/Cas9 system[J].Mol Plant，2017（7）：1007-1010.

[ 3 ] Cheng AW，Wang HY，Yang H，et al.Multiplexed activationof endogenous genes by CRISPR-on，an RNA-guided transcriptional activator system[J].Cell Res，2013，23（10）：1163-1171.

[ 4 ] Wolt JD，Wang K，Yang B.The regulatory status of genome-edited crops[J].Plant Biotechnol J，2016，14（2）：510-518.

[ 5 ] Wang YP，Cheng X，Shan QW，et al.Simultaneous editing of three homoeoalleles in hexaploid bread wheat confersheritable resistance to powdery mildew[J].Nat Biotechnol，2014，32（9）：947-951.

[ 6 ] Ji X，Zhang H，Zhang Y，et al.Establishing a CRISPR-Cas-like immune system conferring DNA virus resistance inplants[J].Nat Plants，2015（1）：15144.

[ 7 ] Baltes NJ，Hummel AW，Konecna E，et al.Conferring resis-tance to geminiviruses with the CRISPR-Cas prokaryoticimmune system[J].Nat Plants，2015，1（10）：15145.

[ 8 ] Ali Z，Abulfaraj A，Idris A，et al.CRISPR/Cas9-mediatedviral interference in plants[J].Genome Biol，2015（16）：238.