不同发酵菌种对大果山楂酵素品质的影响

张巧 ，柯博芳，唐小闲 ，段振华 *

1. 贺州学院食品与生物工程学院（贺州 542899）；2. 贺州学院食品科学与工程技术研究院（贺州 542899）；3. 广西果蔬保鲜和深加工研究人才小高地（贺州 542899）

大果山楂又名麻缺顿、广西楂（商品名）等，为蔷薇科苹果亚科苹果属植物，其果形大，果面光滑明艳，性微温，味甘、酸、涩[1-2]。大果山楂含有多种酚类活性成分，具有降低血清胆固醇和甘油脂，降压利尿和镇静等药用价值，是难得的药食两用食品[3]。目前，以大果山楂作为生产原料的产品有山楂干片、山楂糕、山楂醋等，而山楂酵素这种生物发酵制品却很少见，与之相关的文献也不多。

酵素是一种微生物发酵产品，拥有许多生物活性成分，对于人体生命现象的运动有一定的作用。酵素拥有其他饮料所没有的独特风味、香味和滋味，且富含丰富的酶类（超氧化物歧化酶、蛋白酶、纤维素酶等）、酚类、有机酸类等对人体有益的生物活性物质，还具有抗菌、抗炎、净化、分解消化、润肠通便等作用[4]。现今，随着人们认识到酵素食品的重要性，我国在逐步加快酵素产品的研究。新型的酵素食品将原料扩展为蔬菜、水果、菇类等，酵母菌、乳酸菌和霉菌是其发酵的主要微生物。这些有益菌通过促进一些生化反应的进行，有助于实现糖类、脂质、蛋白质之间相互转化[5]。此外，有益菌还可以对原有的一些不良风味进行改进，产生一些新的功能成分，且酵素食品的功能保健作用增强。王瑾等[6]研究的桑葚酵素就是利用乳酸茵、酵母菌和其他益生菌在特定条件下发酵桑葚原汁得到的一种营养丰富、口感俱佳且美容养颜的功能性发酵饮品。另外，贾丽丽等[7]以酵母菌和乳酸菌发酵冬枣泥得到的冬枣酵素，香气浓郁，酸甜可口，品质得到较大的提升。莫大美等[8]研究，由酵母菌、乳酸菌和醋酸菌发酵的玫瑰酵素比酵母菌和乳酸菌发酵的更优。由此可见，不同发酵菌种对酵素品质有着较为重要的影响。

研究通过自然发酵、单菌种（酵母菌）发酵、双菌种（酵母菌+醋酸菌）发酵以及三菌种（酵母菌+醋酸菌+乳酸菌）发酵来探索这些发酵菌种对大果山楂酵素品质的影响，为大果山楂酵素工艺的研发提供技术支持。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

大果山楂，贺州泰和水果店购买；福林酚试剂（分析纯）：北京索莱宝科技有限公司；2, 2-联苯基-1-苦基阱基（2, 2-Diphenyl-1-picryldrazyl，DPPH）即（分析纯）：上海麦克林生化科技有限公司；没食子酸（分析纯）：天津市大茂化学试剂厂；酚酞（分析纯）：成都市科龙化工试剂厂；无水乙醇、无水碳酸钠、重铬酸钾、三羟甲基氨基甲烷等（分析纯）：广东光华科技股份有限公司。

1.2 仪器与设备

立式压力蒸汽灭菌器，重庆雅玛拓科技有限公司；SW-CJ-1F洁净工作台，苏州安泰空气技术有限公司；高速冷冻离心机，Eppendorf公司；722N型可见分光光度计，上海仪电分析仪器有限公司。

1.3 试验方法

1.3.1 菌种的培养

酵母菌：马铃薯葡萄糖培养基，接种后在30 ℃、180 r/min条件下培养36～48 h。

乳酸菌：MRS培养基，接种后30 ℃培养24～48 h。

醋酸菌：醋酸菌培养基，接种后在30 ℃、180 r/min条件下培养24～48 h。

1.3.2 大果山楂酵素的制备

大果山楂→清洗干净→切块、去核、去梗→盐水护色→清水漂洗→接种→装瓶→加糖→消毒封口→发酵→酵素

操作要点：把大果山楂切成4块，去核去梗，放入0.1%盐水中护色，然后捞出冲洗，沥干。将大果山楂果肉和白砂糖紫外处理45 min，分别接种果肉质量3%的酵母菌、1.5%酵母菌+1.5%醋酸菌、1%酵母菌+1%醋酸菌+1%乳酸菌、等量无菌水，装入灭菌后的发酵瓶中，再在中、上层铺入白糖，大果山楂与白糖质量比3∶1，消毒封口，发酵，发酵过程中，每6 d取样。将所取大果山楂酵素样品离心（12 000 r/min，10 min，10 ℃），测定上清液的总酸度、酒精度、总酚含量、DPPH自由基清除率、羟自由基清除率、SOD酶活力及感官评分。

1.3.3 总酸的测定

参照GB 5009.239—2016测定酵素中的酸度。

1.3.4 总酚含量的测定

总酚含量的测定采用Folin-酚试剂法，具体参考文献[9]，并稍作修改。取0～0.02 mg/mL的没食子酸进行总酚标准曲线的测定，得线性回归方程为：y=1.579 3x+0.013 4（x是没食子酸浓度，y是吸光度），R2=0.998。根据总酚标准曲线方程和样液中的吸光度测定酵素中的总酚浓度。

1.3.5 SOD活力的测定

根据邻苯三酚自氧化法[10]测定SOD，详细做法参照表1，在波长325 nm处每隔15 s测定1次吸光度A0，抑制率和SOD活力分别按照公式（1）和（2）进行计算。

表1 邻苯三酚自氧化速率测定加样表

式中：V1为反应液的总体积，mL；V2为所测样品体积，mL；ΔA0为邻苯三酚自氧化速率；ΔASOD为样品光密度值变化速率；n为稀释倍数。

1.3.6 酒精度的测定

采用重铬酸钾比色法[11]对酵素中的酒精度进行测定。取体积分数0～0.1%的乙醇进行酒精度标准曲线的测定，得线性回归方程为：y=1.517 7x+0.006 2（x是乙醇体积分数，y是吸光度），R2=0.993。根据酒精度标准曲线方程和样液中的吸光度测定酵素中的酒精度。

1.3.7 DPPH自由基清除能力的测定

DPPH自由基清除能力的测定具体参照文献[12]。

1.3.8 感官评审标准

参照表2对酵素产品进行感官评定，具体的感官评定人员均为食品专业人士，并严格按照评分标准进行评分，然后给出相应的分数。

表2 感官评定标准[13]

1.3.9 数据处理

所有数据均为3次以上重复试验的平均值±标准误差，使用Origin 8.0进行作图。

2 结果与分析

2.1 不同发酵菌种对大果山楂酵素中总酸的影响

酸度是衡量大果山楂酵素发酵成熟度的主要指标，同时也是反应大果山楂发酵液品质的重要理化指标[14]。由图1可知，自然发酵、单菌种、双菌种和三菌种发酵的总酸度随着时间的延长呈现出先上升后缓慢下降的趋势。自然发酵在微生物的慢速生长和代谢下产有机酸，而单菌种兼性厌氧酵母菌在前期有氧情况下大量繁殖，抑制其他微生物代谢，产生乙醇和二氧化碳，只有部分二氧化碳溶于水，因此，自然发酵的总酸度要高于单菌种发酵。发酵3～12 d内，总酸度上升趋势较快，且三菌种发酵酸度要高于其他发酵，原因可能是乳酸菌和醋酸菌通过利用酵素液中的营养物质，产生大量的有机酸和醋酸；发酵24～30 d内，总酸度下降的幅度都不大，基本趋于平稳。

图1 不同发酵菌种对大果山楂酵素中总酸的影响

2.2 不同发酵菌种对大果山楂酵素中总酚的影响

大果山楂发酵过程中酚类物质是其重要的功能性成分，对其口感有着决定性作用，同时对酵素的色泽、香气以及抗氧化性有一定的影响[15]。由图2可知，自然发酵、单菌种、双菌种、三菌种发酵的总酚浓度先不断升高后趋于平缓，由初始1 mg/mL左右上升到6～8 mg/mL，这主要是因为在发酵过程中，大果山楂中的酚类物质随着发酵时间的延长，逐渐溶入到山楂酵素液中[16]。发酵3～12 d，总酚浓度升高趋势较大；发酵至24 d，总酚含量开始略微下降，有可能是酚类物质氧化的原因；这2个过程都能看出这4种发酵总酚浓度的高低，三菌种发酵＞双菌种发酵＞单菌种发酵＞自然发酵。

2.3 不同发酵菌种对大果山楂酵素中SOD活性的影响

生物体在新陈代谢的过程中往往会产生有害物质，SOD能起到消除的作用。有研究发现，它能抑制心脑血管疾病，也有抗衰老、抗疲劳、抗辐射等效果[17]。大果山楂发酵过程中产生的SOD酶活性物质可以提高免疫力，是细胞防御系统中主要的抗氧化酶[18]。如图3所示，发酵过程中，三菌种发酵、双菌种发酵、单菌种发酵以及自然发酵的酵素SOD酶活力在24 d时达到最高，依次为21.59，19.85，18.72和16.27 U/mL；24～30 d的SOD酶活力均趋于平缓。可以看出，三菌种发酵的酵素SOD酶活力最高，双菌种发酵次之，其次是单菌种发酵，最后是自然发酵。

图2 不同发酵菌种对大果山楂酵素中总酚的影响

图3 不同发酵菌种对大果山楂酵素中SOD活性的影响

2.4 不同发酵菌种对大果山楂酵素中酒精度的影响

由图4可知，随着时间变化，自然发酵、单菌种发酵、双菌种发酵和三菌种发酵的酒精度呈现先升后降的变化趋势。发酵18 d，单菌种发酵的酒精度最高点达到25.7%vol，自然发酵、双菌种发酵、三菌种发酵的酒精度最高点依次为16.7%，13.7%和12.6%vol，单菌种发酵的酒精度远远高于其他发酵，这是因为酵母菌在产生大量酒精的同时，还抑制了其他微生物的生长，使得酵素酒味偏重。相对来说，三菌种发酵的酒精度随时间变化都比其他发酵的要小，原因可能是醋酸菌和乳酸菌的生长繁殖，使得酵母菌可利用的营养物质减少，酒精的形成量降低。

2.5 不同发酵菌种对大果山楂酵素中DPPH自由基清除率的影响

由图5可知，随着时间的延长，通过接种4种发酵菌种的大果山楂酵素，其DPPH自由基清除率的变化趋势为先上升后下降。DPPH自由基清除能力与总酚的浓度有一定的关联，一开始随着总酚浓度的升高而呈现上升的趋势，后面出现缓慢下降可能是抗氧化活性强的物质被微生物降解或者通过结构修饰成抗氧化活性弱的物质所造成的[19]。发酵18 d，三菌种发酵的酵素DPPH自由基清除率达到最大值88.9%，比其他发酵高。发酵24 d，单菌种发酵的酵素DPPH自由基清除率达到最大值85.7%，但比双菌种和三菌种发酵低。因而总体来说，三菌种发酵的酵素DPPH自由基清除能力最强，双菌种发酵次之，其次是单菌种发酵，最后是自然发酵。

图4 不同发酵菌种对大果山楂酵素中酒精度的影响

图5 不同发酵菌种对大果山楂酵素中DPPH自由基清除率的影响

2.6 不同菌种发酵大果山楂过程中感官评分的变化

由图6可知，随着时间的变化，自然发酵、双菌种发酵和三菌种发酵的感官评分呈现出上升的趋势，最后趋于平稳，最高评分都能达到80分以上，三菌种评分最高，88.2分。而单菌种发酵的感官评分变化为先下降后上升，最后稍微上下波动，其评分最差，低于60分。总体看来，感官评分高低顺序为：三菌种发酵＞自然发酵＞双菌种发酵＞单菌种发酵。

图6 不同菌种发酵大果山楂过程中感官评分的变化

3 结论

在大果山楂发酵过程中，自然发酵、单菌种、双菌种和三菌种发酵的总酸度随着时间的延长呈现出先上升后缓慢下降的趋势，其中三菌种发酵的酵素总酸度相对偏高，适当的酸能柔和酒精所带来的苦涩味，提高酵素的营养物质，赋予其独特的风味；发酵18 d时，单菌种发酵的酵素酒精度最高，达到25.7%vol，自然发酵次之，其次是双菌种发酵，最后是三菌种发酵，酒精度稍低，酵素的口感不会那么苦涩；由于总酚对抗氧化性有一定的影响，因此，发酵过程中，总酚浓度升高，DPPH自由基清除率和SOD酶活力也随之上升，且三菌种发酵＞双菌种发酵＞单菌种发酵＞自然发酵；结合感官评分，酵母菌、醋酸菌和乳酸菌三菌种发酵的酵素品质更佳。