山楂原液果胶酶解工艺

王菲菲，李栋，赵俊梅，牟德华, *

1. 河北科技大学生物科学与工程学院（石家庄 050000）；2. 河北省（承德）山楂产业技术研究院（承德 067300）

山楂富含抗坏血酸、花青素和黄酮类化合物[1]，研究结果证实山楂中的这些活性物质对心血管系统具有保护作用和治疗作用，包括心血管保护、降血压活性、降胆固醇血症和降血脂作用等[2-4]。很多学者也已经通过体内体外试验证明山楂多酚和黄酮具有显著的抗氧化能力，可以显著地降低大鼠血脂中的TC、LDL含量，并且对TG、HDL有调节作用[5-6]。目前，市面上山楂制品，包括山楂片、山楂罐头、果丹皮、山楂汁、山楂酵素饮料等，但是山楂高附加值产品种类较少，基于山楂显著的降血脂功效，开发新型山楂制品和山楂功能性产品具有很重要的现实意义。

山楂中果胶类物质含量较高，为2%～4%，并且山楂果胶的黏度也比柠檬和苹果果胶高得多[7]。高黏度果胶的存在使得山楂原液在喷雾干燥过程中极易产生粘壁现象，导致原料损失严重，在很大程度上阻碍了山楂的深加工[8-10]。

果胶酶是一类能够催化果胶降解的复合酶。自然界中的果胶大都由半乳糖醛酸单元通过α-1, 4-糖苷键连接、聚合，甚至被甲酯化而形成[11-12]。果胶酶根据作用位点不同，可以将其分为原果胶酶、解聚酶、果胶酯酶、半乳糖醛酸酶等，其中原果胶酶能够降解不溶性果胶，解聚酶作用于果胶结构中的α-1, 4-糖苷键，果胶酯酶发挥脱甲酯作用，半乳糖醛酸酶则将果胶水解成为半乳糖醛酸单体[13]。在工业上，果胶酶常被用于生产果胶低聚糖[14]、果汁澄清[15]、果酒澄清[16]、果醋澄清[17]、脱除果胶[18]等。通过喷雾干燥的方式制备一种高附加值的山楂原粉，需要脱除山楂原液中的部分果胶。鉴于酶法脱胶高效性和专一性的特点，此次试验采用特异性的果胶酶脱除山楂原液中的果胶。

1 材料与方法

1.1 材料

干山楂片，神威药业（石家庄）中药饮片有限公司。

1.2 试剂

氢氧化钠、冰乙酸、氯化钙，均为本地试剂公司生产的分析纯试剂。Pectinex Yield MASH果胶酶，诺维信（中国）生物技术有限公司提供；裂解酶，中国农业科学院生物技术所提供；LALLZYMEEX果胶酶，法国Laffort公司；果胶酶，山东隆科特酶制剂有限公司提供。

1.3 仪器与设备

水浴锅，上海胜启仪器仪表有限公司；Sartorius水分测定仪，赛多利斯科学仪器（北京）有限公司；DEL7A320 pH计，上海展仪仪器设备有限公司；Adventurer电子分析天平，美国奥豪斯仪器有限公司。

1.4 样品的制备

取适量的干山楂片，按照料液比1∶10（g/mL）的比例向其中加入去离子水，在60 ℃水浴锅中加热提取2 h，冷却，过滤，得到山楂原液。

1.5 果胶酶的筛选

已经有研究报道，山楂果胶结构主要为HG和RG-Ⅱ型[19]，根据不同种类的果胶酶作用位点的特异性，选用Pectinex Yield MASH果胶酶（半乳糖醛酸酶）、裂解酶、LALLZYMEEX果胶酶（纤维素酶）和果胶酶4种果胶水解酶，分别取0.5 mL 10 U/mL的果胶酶，加入到50 mL山楂原液中，在40 ℃水浴条件下酶解30 min，根据张方艳等[20]的方法分别测定酶解前后山楂果胶含量，酶的作用效果用果胶脱除率来表示。

1.6 果胶的测定

准确移取25 mL滤液于250 mL锥形瓶中，加入100 mL 0.1 mol/L氢氧化钠，放置30 min，再加入50 mL 1 mol/L醋酸溶液，放置5 min后加入50 mL 2 mol/L氯化钡溶液，放置30 min。加热沸腾5 min后立即用称量过干质量的滤纸抽滤，用热水洗涤至无氯根为止（用硝酸银溶液检查无白色沉淀），取出滤纸称量干质量。

1.7 果胶酶酶解单因素试验

1.7.1 果胶酶添加量对果胶水解的效果的影响

取5份50 mL山楂原液，分别放在5个250 mL锥形瓶中，加入50 mL水，调节pH至4.0，向其中分别加入5，10，15，20和25 U Pectinex Yield MASH果胶酶，在40 ℃水浴加热条件下酶解30 min，取出后加几粒沸石，加热煮沸1 h，并补充蒸发损失的水，冷却后移入100 mL容量瓶中，定容后摇匀，抽滤，测果胶含量。

1.7.2 酶解时间对果胶水解效果的影响

取5份50 mL山楂原液，分别放在5个250 mL锥形瓶中，加入50 mL水，调节pH至4.0，向其中分别加入10 U Pectinex Yield MASH果胶酶，在40 ℃水浴加热条件下分别酶解30，60，90，120和150 min，取出后加几粒沸石加热煮沸1 h，并补充蒸发损失的水，冷却后移入100 mL容量瓶中，定容后摇匀，抽滤，测果胶含量。

1.7.3 酶解温度对果胶水解效果的影响

取5份50 mL山楂原液，分别放在5个250 mL锥形瓶中，加入50 mL水，调节pH至4.0，向其中分别加入10 U Pectinex Yield MASH果胶酶，分别在20，30，40，50和60 ℃水浴加热条件下酶解30 min，取出后加几粒沸石加热煮沸1 h，并补充蒸发损失的水，冷却后移入100 mL容量瓶中，定容后摇匀，抽滤，测果胶含量。

1.8 果胶含量及果胶脱除率的计算方法

式中：G为滤渣质量，g；W为样品质量，g；0.738 0为果胶酸钡换算为果胶质的系数。

式中：a为山楂原液果胶含量；b为脱胶处理后山楂原液果胶含量。

1.9 数据统计分析

采用Excel 2010，Design-Expert 6.0.10和Origin 8.0进行数据处理。

2 结果与讨论

2.1 果胶酶的筛选

通过重量法测定果胶的百分含量，结果如表1所示。

表1 不同类型果胶酶的果胶脱除率

聚半乳糖醛酸酶（PG）对果胶结构中的α-1, 4糖苷键具有酶解效果，可以随机断裂果胶主链内部非酯化半乳糖醛酸间的α-1, 4糖苷键，产生不同聚合度的果胶分子[21]；而裂解酶（PL）是通过β-反式消除作用切割α-1, 4-糖苷键，只能对甲酯基旁边的α-1, 4糖苷键具有酶解效果[22-23]；纤维素酶则通过水解多糖分子中的β-1, 4-糖苷键来达到水解多糖分子的效果。所选的四种商品酶均为复合酶，都具有总果胶酶活性、半乳糖醛酸酶活性、裂解酶活性和纤维素酶活性，它们对果胶的酶解效果也因不同配方果胶酶产生差异，根据这四种商品酶的最高酶活将其分为聚半乳糖醛酸酶、裂解酶、纤维素酶和果胶酶。

在加酶量和酶解时间相同的条件下，半乳糖醛酸酶活性较强的Pectinex Yield MASH果胶脱除率最高，达到89.13%，四种果胶酶的果胶脱除率在10%～90%之间不等，差异较为显著，根据此次试验目的，最终选用果胶脱除率最高的Pectinex Yield MASH酶。

2.2 单因素试验

2.2.1 果胶酶添加量对果胶脱除率的影响

从图1可以看出，随着果胶酶添加量的增大，山楂原液中果胶的脱除率总体呈现逐渐增大的趋势。当加酶量低于8 U时，曲线的斜率也随加酶量的增大而增大，尤其是当加酶量从6 U增大到8 U时，果胶脱除率增幅最大；当加酶量大于8 U时，果胶脱除率缓慢增长；当加酶量为10 U时，果胶脱除率达到93%；当加酶量继续增大到12 U时，山楂原液中果胶的脱除率达到100%。这一结果符合Henri的酶底物中间物复合物学说和酶促反应动力学方程，即当底物浓度远远高于酶的浓度时，由于酶的数量有限，所以果胶脱除率较低，随着酶浓度的增加，越来越多的酶与底物结合，反应体系先达到稳态，即中间复合物的生成速率与分解速率相等，酶促反应速率达到最大；随着酶浓度的进一步增加，底物浓度低于酶浓度，反应速率与底物浓度呈正比，其关系与一级反应动力学相符[24]。倪文兵等[25]用果胶酶酶解红枣浆，得到了类似的结果，当果胶酶添加量低于0.02%时，红枣浆出汁率随着加酶量的上升而不断提高，当加酶量超过0.02%时，随着加酶量的继续增大，出汁率基本不变，此时原料中的果胶近乎完全分解[26]。

图1 加酶量对果胶脱除率的影响

2.2.2 酶解时间对果胶脱除率的影响

从图2可以看出，在0～30 min之内，随着时间的延长，果胶的脱除率呈现一个明显的增高趋势，并且其增大的速率呈现由大到小的变化，这符合酶催化作用高效性的特点。当酶解时间为30 min时，果胶的脱除率达到80%以上。超过30 min之后，果胶脱除率的变化量逐渐减小，直到最后趋近于0，果胶的脱除率达到93.54%。闫子柱等[27]、汪建红[28]、毕凯媛等[29]、冯军伟等[30]分别用果胶酶脱除不同原料中的果胶，其酶解时间均在1～4 h之间，果胶脱除率能达到99%左右。

2.2.3 酶解温度对果胶脱除率的影响

从图3可以看出，随着温度的上升，果胶脱除率呈现先上升后下降的趋势，当酶解温度达到40 ℃时，果胶的脱除率达到最高，为98.08%，随着温度的进一步上升，果胶脱除率反而下降，这是因为酶的活性受到温度的影响，高温或低温均会影响酶的活性，只有在酶的最适温度条件下，酶才会最大限度地发挥作用。单因素结果表明，40 ℃是Pectinex Yield MASH果胶酶的最适温度，在此温度下该果胶酶能最大限度地发挥作用。在果胶酶脱胶领域，众多研究报道证明果胶酶的最适温度在40～50 ℃之间，过低或过高的温度都不能使果胶酶发挥其最大的作用[27-30]。

图2 酶解时间对果胶脱除率的影响

图3 酶解温度对果胶脱除率的影响

2.3 单因素方程的拟合

为了确定脱胶的最优条件，在Design-Expert 6.0.10分析软件中设定果胶酶添加量、酶解时间、酶解温度这三个因素的取值范围，如表2所示。

表2 响应面分析方法取值范围

2.4 响应面分析法优化脱胶工艺

2.4.1 Box-Behnken试验设计及结果

以酶解时间、加酶量、酶解温度为自变量，以果胶脱除率为响应值，响应面试验分析及结果如表3所示。

2.4.2 模型方程的建立及显著性检验

采用Design-Expert软件对表2所得的果胶脱除率试验数据进行回归拟合（表4），得到加酶量（A）、酶解时间（B）、酶解温度（C）为自变量对果胶脱除率的回归方程：果胶脱除率=84.51+3.72A+1.76B+3.26C-0.61AB+2.72AC+0.34BC。通过表4得出，整体模型的p=0.000 2＜0.01，表明二次模型极显著，失拟项p=0.078 8＞0.05，不显著，表明此二项模型拟合有效，可以分析和预测各因素与响应值的关系。各影响因素的主次顺序为：A（加酶量）＞C（酶解温度）＞B（酶解时间）。

表3 响应面试验分析及结果

表4 回归模型的方差分析

2.4.3 三个因素的响应面分析

等高线的形状则反映了各因素之间的交互作用，等高线呈椭圆形说明因素之间有交互作用，并且椭圆形越密集，两因素之间的交互作用越显著[31-33]。

从表4可以看出，因素A，B，C均能显著影响果胶脱除率，尤其是因素A和C的p值均小于0.01，影响作用极显著。从图4（a）和（c）可以看出，酶解时间与加酶量、酶解温度之间等高线的形状在试验条件范围内近似为直线，结合表4可以看出pAB和pBC均大于0.05，说明因素B（时间）与因素A（加酶量）、因素C（酶解温度）之间不存在显著的交互作用。而酶解温度和加酶量之间等高线的形状为椭圆，有一定的密集度，并且pAC=0.011 5＜0.05，说明因素A（加酶量）和因素C（酶解温度）之间存在显著的交互作用。

图4 各因素交互作用对果胶脱除率的影响

2.4.4 山楂原液果胶脱除最佳工艺参数的确定及验证试验

用Design-Expert 6.0.10软件求回归方程的极值点，得到果胶脱除的最佳工艺条件：加酶量11.68 U、酶解时间51.58 min、酶解温度44.18 ℃，在此条件下的果胶脱除率理论预测值为90.18%。对最佳脱胶工艺条件进行验证试验，考虑到实际实验操作，将最佳脱胶工艺条件调整为：加酶量12 U、酶解时间52 min、酶解温度45 ℃，在此条件下实际测得果胶脱除率为90.58%，与调整之前的预测值接近。

3 讨论与结论

大量的研究已经证明，山楂中的黄酮、多酚、多糖和有机酸等物质具有一定的降血糖和降血脂效果[5,34-36]，因此，研究山楂加工新技术，充分开发利用山楂资源，提高山楂的经济价值具有重要意义。

结果表明，具有半乳糖醛酸酶活性的果胶酶对于山楂果胶的水解效果最好，而半乳糖醛酸酶的作用主要是将原料中的果胶酸降解为半乳糖醛酸，说明成熟的山楂果实中果胶主要以果胶酸的形式存在。另外，通过对果胶酶添加量、酶解时间、酶解温度三个因素进行响应面优化试验，得到山楂果胶最佳的脱除工艺，有效地解决了山楂原粉喷雾干燥过程中粘壁的问题，为山楂原粉及其他高附加值山楂制品的开发提供了理论基础。