脂肪干细胞对绝经后骨质疏松大鼠骨密度、骨形态学影响的研究

汪玉海，王志斌，张小钰，金丽娟

骨质疏松的发生与年龄、性别、环境、遗传等因素有关，绝经后女性由于雌激素缺乏、骨质疏松的发病率明显增加，绝经后女性也被认为是发生骨质疏松的高危人群[1-3]。雌激素在体内具有广泛的生物学活性，绝经后女性雌激素缺乏引起骨质疏松的可能机制包括[4-6]：抑制成骨细胞分化、促进破骨细胞分化，使成骨活性超过破骨活性中导致骨量不断丢失；刺激多种炎症细胞因子的释放、破坏骨代谢平衡并引起骨量丢失；激活细胞凋亡、抑制细胞增殖并使成骨细胞的数目减少、引起骨量丢失。因此，对骨代谢过程进行干预是目前治疗绝经后骨质疏松的重要靶点[7-8]。脂肪干细胞，已经被证实能够向成骨细胞分化并用于骨质疏松模型大鼠的治疗[9-10]，且与骨髓间充质干细胞比较，具有来源丰富、取材简单、获得率高等优势[12-13]，但脂肪干细胞移植用于绝经后骨质疏松大鼠治疗的价值及机制均未明确。通过双侧卵巢切除法建立了绝经后骨质疏松大鼠模型，研究脂肪干细胞移植对骨质疏松大鼠骨密度、骨形态的影响。

1 资料与方法

1.1 一般资料：本实验于2016年6-12月在宁夏医科大学完成。选取3月龄SD 雌性大鼠42只，体重(180±20)g，由宁夏医科大学实验动物中心提供，许可证号：SCXK(宁)2015-0001。

1.2 实验材料：大鼠脂肪间充质干细胞(南京科佰生物科技有限公司)液氮内冷冻保存，小牛血清(甘肃民海生物公司)，胰蛋白酶(美国SIGMA公司)，骨密度仪(美国GE公司)，DMEM培养基、胰蛋白酶(Gibco公司)，HE染色试剂盒(上海碧云天公司)，

1.3 实验方法

1.3.1 脂肪干细胞培养及细胞悬液的制备：脂肪干细胞用含有10%胎牛血清的DMEM进行贴壁培养，密度生长至90%后用胰蛋白酶消化、以1∶3传代继续培养；收集第4代脂肪干细胞，用磷酸盐缓冲液调整细胞密度至2×107/mL，按照100 μl/管分装细胞。

1.3.2 大鼠模型建立：将大鼠分为假手术组、骨质疏松对照组、骨质疏松脂肪干细胞移植组。

1.3.2.1 绝经后骨质疏松大鼠模型建立：32只SD雌性大鼠经2%戊巴比妥钠(40 mg/kg)腹腔内注射麻醉，腹部正中纵行切口逐层切开，找到卵巢丝线结扎后摘除，逐层缝合后任其自由活动。喂养 12 周后通过双能X线吸收仪(DEXA)骨密度法测量SD大鼠脊柱全长的骨密度，确定造模是否成功，选取造模成功的26只大鼠进入实验。

1.3.2.2 假手术组大鼠模型建立：10只SD雌性大鼠按照相同的方法麻醉并将脂肪团拉出，仅切除卵巢附近的脂肪组织适量、不摘除卵巢。常规喂养。

1.3.3 脂肪干细胞移植：造模成功的26只大鼠以1.6∶1分为骨质疏松脂肪干细胞移植组16只与骨质疏松10只。脂肪干细胞移植组将100 μl细胞密度为2×107/mL的脂肪干细胞悬液进行尾静脉注射，每周1次，连续8周；骨质疏松对照组和假手术组给予生理盐水100 μl尾静脉注射，每周1次，连续8周。

1.3.4 指标测定：饲养至第8周，分别处死骨质疏松组、脂肪干细胞移植组、假手术组大鼠，完整取出股骨，剔除肌肉，先行双能X线骨密度测定，后行骨形态学测定。右侧股骨行测量总组织面积、骨小梁面积、骨小梁周长，按照骨小梁面积/总组织面积×100%骨小梁面积百分比(2/1.99)×(骨小梁面积/骨小梁周长)计算骨小梁厚度、(总组织面积-骨小梁面积)/骨小梁周长计算骨小梁间距等骨形态学测定。骨矿盐测定：左侧股骨放入105 ℃烤箱中烘烤5～6 h，达恒重后称量干重，而后将烤干后的股骨放入650 ℃的灰化炉中灰化36 h，称量灰化后样品的重量，灰化后重量与干重之比为矿物质盐的含量。

2 结果

2.1 各组大鼠骨密度的比较：与骨质疏松组比较，脂肪干细胞移植组大鼠左侧股骨及右侧股骨的骨密度均明显升高(P<0.05)；与假手术组比较，骨质疏松组左右两侧股骨的骨密度明显降低(P<0.05)；与骨质疏松组比较，脂肪干细胞移植组两侧股骨的骨密度明显增高(P<0.05)，见表1。

表1 3组大鼠骨密度的比较

2.2 3组大鼠骨形态的比较：与假手术组比较，骨质疏松组大鼠右侧股骨中的骨小梁面积百分比、骨小梁厚度明显降低，骨小梁间距明显增加(P<0.05)；与骨质疏松组比较，脂肪干细胞移植组大鼠右侧股骨的骨小梁面积百分比、骨小梁厚度明显增加，骨小梁间距明显降低(P<0.05)，见图1-图3(目录后)。

2.3 3组大鼠骨组织中矿物质盐含量的比较：假手术组左侧股骨中矿物质盐含量为(0.412±0.075)g/g，骨质疏松组为(0.247±0.045)g/g，骨质疏松脂肪干细胞移植组为(0.352±0.068)g/g，3组比较差异有统计学意义(F=7.04，P<0.05)。骨质疏松组与假手术组比较，矿物质盐的含量明显降低(P<0.05)；与脂肪干细胞组比较，骨质疏松组矿物质盐的含量明显降低(P<0.05)。

3 讨论

骨质疏松发病的根本原因是成骨细胞介导的骨形成过程及破骨细胞介导的骨吸收过程平衡的打破。雌激素对成骨细胞和破骨细胞的分化、增殖均具有调控作用，绝经后雌激素的缺乏通过影响成骨细胞和破骨细胞来引起骨代谢异常、造成骨量丢失并引发骨质疏松[14-16]。近年来，组织工程技术在骨质疏松治疗中的价值受到了越来越多的关注，具有多项分化潜能的干细胞是治疗骨质疏松理想的组织工程种子细胞。骨髓间充质干细胞、脂肪干细胞是目前临床上使用较为广泛的干细胞类型，两种均被证实具有成骨分化的潜能，并且已有研究证实骨髓间充质干细胞移植能够使骨质疏松大鼠的骨密度增加、骨形态改善[9-10]，但脂肪干细胞移植用于骨质疏松大鼠治疗的研究并不多。脂肪干细胞具有来源广泛、扩增能力强、获得率高、伦理限制少的优势，是更为理想的种子细胞。

目前公认的与临床最相似的绝经后骨质疏松动物模型是采用去势法构建的去卵巢大鼠模型,因其造模成功率高、方法简便，故得到了广泛应用[11]。美国食品与药物管理局(FDA)和世界卫生组织(WHO)认为，去卵巢大鼠为研究绝经后骨质疏松的最佳动物模型。因此本研究采用此法将雌性SD大鼠双侧卵巢切除，建立绝经后骨质疏松大鼠模型。

实验结果与假手术组相比，骨质疏松模型大鼠两侧股骨的骨密度均明显降低，骨形态表现为骨小梁面积百分比、骨小梁厚度的降低以及骨小梁间距的增加，说明骨质疏松模型大鼠发生了骨量丢失以及骨形态改变，印证了通过摘除雌性大鼠双侧卵巢可以成功建立大鼠骨质疏松模型；在造模后通过移植脂肪干细胞，实验结果中脂肪干细胞组的骨密度、骨小梁面积百分比、骨小梁厚度均明显高于骨质疏松模型组，骨小梁间距明显低于骨质疏松模型组，说明脂肪干细胞移植能够使绝经后骨质疏松大鼠的骨密度增加、骨形态得到改善，同时在移植脂肪干细胞后，骨质疏松大鼠骨组织中矿物质盐的含量明显增加，说明脂肪干细胞对绝经后骨质疏松模型大鼠的骨代谢具有改善作用。本实验结果证实，移植进入机体内的脂肪干能够纠正成骨细胞与破骨细胞失衡的状态，对绝经后骨质疏松模型大鼠的骨代谢具有改善作用，并能增加骨质疏松模型大鼠的骨密度、改善骨形态。

本研究证实，脂肪干细胞移植可以增加骨质疏松模型大鼠的骨密度，改善骨形态，并能提高骨矿盐含量。本研究不足之处是脂肪干细胞是通过何种作用机制、通过何种分子通道发挥前述作用的，还需要进一步研究。