轻中度精索静脉曲张所致精子DNA碎片异常行保守干预对体外受精胚胎质量的影响

袁启龙 蒋满波 陆杉 卢兴宏 倪运萍 周文 陈志强

广州中医药大学第二附属医院生殖医学科（广州510006）

鉴于精子常规参数对于体外受精胚胎移植（in vitrofertilization-embryo transplantation，IVF-ET）助孕结局的评估价值有限，IVF 治疗过程中既往常忽视男性精子质量因素对胚胎发育潜能的影响［1-2］，近几年精子功能检查指标精子DNA 碎片（sperm DNA fragmentation，SDF）引入临床检查后，关于SDF 异常对胚胎发育潜能和IVF 助孕结局的影响多有报道［3-4］，但临床针对SDF 异常的诊治方案多为经验性治疗，如轻中度精索静脉曲张（varicocele，VC）所致SDF 异常采用手术治疗效果尚存争议，而临床保守干预措施方面亦缺乏权威性诊疗规范，专家共识多集中在改善局部血液循环和抗氧化应激方面［5-7］。本研究选取临床常见且病因相对明确的轻中度VC 所致SDF 异常患者作为研究的突破口，分析该类患者临床常采用的保守干预措施是否能有效降低SDF，以及各保守干预措施之间的治疗效果是否存有显著差异，并分析各保守干预方案是否对后续IVF 助孕所获取的胚胎质量产生差异性影响，以评估该类患者进行IVF助孕治疗前的预处理是否有必要性及采用哪种干预更为合适。针对上述疑问，本研究特前瞻性设计分析比较临床3 种常用保守干预措施的治疗效果，现将研究结果报道如下。

1 资料与方法

1.1 一般资料选取2018年4月至2019年10月期间在我科行IVF 助孕治疗，完善病史询问及相关检查后诊断为轻中度VC 合并SDF 异常的患者，选取要求并采用保守干预后进入IVF 治疗周期的人群作为研究对象，共纳入120 例。采用随机数字表法将研究对象随机分为迈之灵片治疗组、维生素E 治疗组和空白对照组，每组纳入患者40 例，纳入前均向患者告知干预措施随机分组方式，详细介绍各干预措施已知的研究报道，告知研究过程及各组干预可能的获益等，并获得患者知情同意，本研究已通过广东省中医院伦理委员会批准，批号：BF2018-027-01。

1.2 病例筛选标准

1.2.1 纳入标准（1）轻中度VC 不育症患者；（2）SDF＞30%；（3）男方年龄在23～42 岁之间；（4）配偶年龄21～38 岁，预计可获取5 枚及以上卵子；（5）VC 所致SDF 异常选择保守治疗并自愿参加研究者。

1.2.2 排除标准（1）排除其它致病因素所致SDF 异常患者；（2）排除先天性生殖系统畸形患者；（3）排除体质量指数≥28 kg/m2的患者；（4）排除近期服用损害生育药物或接触有害环境并处于作用期的患者；（5）排除未能配合完整周期治疗的患者。

1.3 主要试剂与仪器精子DNA 碎片测定试剂盒购自深圳华康生物医学工程有限公司（批号：201706-201806），改良巴氏染色液购自南京欣迪公司；主要仪器为西班牙SCA 全自动精子质量分析系统和尼康50i 相差显微镜。

1.4 精液常规和精子DNA 碎片分析嘱咐患者禁欲3～7 d，用自慰方法将完整精液收集于无菌且干燥的容器内，置于36 ℃恒温箱进行液化，液化后根据第5 版《WHO 人类精液检查与处理实验室手册》标准评估精液常规参数［8］，采用精子染色质 扩 散（sperm chromatin dispersion，SCD）检 测SDF，其检验原理是DNA 完整的精子在经过变性和去掉核蛋白后DNA 扩散形成特征性的光晕，而存在DNA 碎片的精子不会产生这种特征性的光晕，根据光晕的有无和大小判断精子的DNA完整程度，具体操作参照深圳华康SDF 检测试剂盒。

1.5 治疗方法迈之灵片治疗组：德国礼达大药厂生产的迈之灵片（产品批号8324），口服，每次1粒，每日2 次，配合良好的生活习惯，连续干预12周；维生素E 治疗组：浙江医药股份有限公司新昌制药厂生产的来益天然维生素E 胶囊（产品批号：150312），口服，每次1 粒，每日2 次，配合良好的生活习惯，连续干预12 周；空白对照组：良好的生活习惯，连续维持12 周。

1.6 指标评估

1.6.1 治疗前3 组精液参数比较3 组治疗前精子参数是否具有可比性，具体指标为精液量（semen volume，V）、精子浓度（sperm concentration，C）、前向运动精子比例（progressive sperm rate，PR）、正常形态精子比例（normal sperm rate，N）、精子总数（total number of sperm，TNS）、前向运动精子总 数（total number of progressive motility sperm，TNPS）、正常形态精子总数（total number of normal form sperm，TNNS）和SDF。

1.6.2 各组治疗前后SDF 配对比较比较各组治疗前后SDF 有无差异，以评估各组干预措施的对SDF 的治疗效果。

1.6.3 治疗后3 组精液常规参数及SDF 改善情况比较精子参数同1.6.1 所述，同时分析3 组干预对SDF 改善率和治愈率是否存有显著性差异。SDF 疗效评定标准：经干预后SDF 在原来基础上降低30%及以上或恢复正常，统称为改善，恢复正常称为治愈［9］。

1.6.4 治疗后3 组行IVF 治疗胚胎培养室指标比较比较3 组配偶获卵数、受精率、正常受精率、卵裂率、可利用胚胎率和优质胚胎率有无差异。

1.7 统计学方法采用SPSS 16.0 软件进行数据统计分析。计量资料数据以均数±标准差表示，治疗前后两样本均数比较采用配对t检验，组间比较采用单因素方差分析检验（百分率统计采用平方根反正弦变换后分析）；SDF 改善率和治愈率，以及胚胎参数计数资料比较采用χ2检验，以P＜0.05 为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 3 组治疗前各项精液参数比较治疗前3 组精液常规常规参数（单项指标和总体参数）和SDF均无显著差异，为表示区别，治疗前上述精子参数英文简写后缀加1，3 组间各组基础参数均衡，具有可比性，见表1。

表1 3 组治疗前精子单项和总体参数比较Tab.1 Three groups comparison of sperm parameters before treatment ±s

表1 3 组治疗前精子单项和总体参数比较Tab.1 Three groups comparison of sperm parameters before treatment ±s

注：其中PR1、N1 和SDF1 等百分率数据均数采用中位数，统计分析百分率采用平方根反正弦变换后方差检验

类别迈之灵组维生素E 组空白对照组F 值P 值V1 3.770±1.110 3.668±1.295 3.435±1.156 0.833 0.437 C1 53.315±35.250 55.488±43.426 58.530±27.795 0.211 0.810 TNS1 189.616±121.337 184.568±121.593 195.401±98.743 0.090 0.914 PR1（%）21.3 23.5 23.9 0.046 0.955 TNPS1 44.537±33.010 47.418±38.379 48.933±31.976 0.167 0.846 N1（%）2 2 1.5 1.178 0.311 TNNS1 3.800±3.400 4.608±4.247 3.610±2.743 0.907 0.407 SDF1（%）40.8 43.4 41.4 0.459 0.633

2.2 各组治疗前后SDF 配对比较各组治疗后SDF 均较之前差异有统计学意义，各组对于精索静脉曲张导致的SDF 损伤均有改善作用，包括空白对照组生活习惯的调整，见表2。

表2 各组治疗前后SDF 配对比较Tab.2 Each group SDF comparison before and after treatment%

2.3 3 组治疗后各项精液参数、SDF 改善率及治愈率比较治疗后3 组精液参数单项指标差异均无显著性意义；PR2 和TNPS23 组间差异无显著性意义，但两两比较LCD 检验发现迈之灵组明显高于空白对照组（P＜0.05）；3 组间SDF2 差异有显著性意义，LCD 检验发现迈之灵组与其它两组均差异有统计学意义（P＜0.05）；其余治疗后指标差异未见显著性意义，见表3。

2.4 3 组治疗后胚胎培养室指标比较不同预处理后，3 组间SDF 存有差异，迈之灵治疗组优质胚胎率优于维生素E 治疗组和空白对照组，其余未见明显异常，见表4。

3 讨论

辅助生殖技术的临床应用为不孕症夫妇提供了有效的助孕方案，既往关于影响成功率的因素研究多集中在女方卵巢功能、子宫内膜环境和促排卵方案的选择方面［10］，但临床结局的提升难以实现进一步的突破，近几年发现精子的部分功能检查指标可能与胚胎的发育潜能存有相关性，其中报道较多的是SDF［11］。VC 是导致男性不育的重要因素之一，其引发的睾丸及其附件部位微循环障碍，可损害精子核遗传物质的完整性，传统治疗观念认为手术可解决解剖结构的异常，特别是显微手术的临床应用降低了VC 复发率。但近期研究认为，对于轻中度VC 导致SDF 异常的手术治疗，尚缺乏设计合理且证实优于其他治疗的临床试验，且临床患者亦多倾向于药物保守治疗［12-13］。IVF 治疗前对该类患者给予药物的获益程度，以及何种药物的预处理更能有效改善胚胎的发育潜能尚无较多数据支持。

表3 3 组治疗后精子单项和总体参数情况比较Tab.3 Three groups comparison of sperm parameters after treatment ±s

表3 3 组治疗后精子单项和总体参数情况比较Tab.3 Three groups comparison of sperm parameters after treatment ±s

注：其中PR2、N2 和SDF2 等百分率数据均数采用中位数，PR2 和SDF2 统计分析采用平方根反正弦变换后方差检验；表示经LCD 检验，与迈之灵组比较，*P＜0.05；SDF 改善率和治愈率分析采用χ2检验

类别迈之灵组维生素E 组空白对照组F/χ2值P 值V2 3.798±1.070 3.825±1.406 3.588±1.160 0.453 0.637 C2 69.343±40.267 67.715±46.068 60.503±28.253 0.585 0.559 TNS2 251.391±129.466 230.361±118.945 209.048±94.948 1.348 0.264 PR2（%）29.45 27.10 26.0*2.507 0.086 TNPS2 78.8346±46.967 65.3545±43.208 58.5888±34.611*2.418 0.094 N2（%）2 2 2 0.282 0.755 TNNS2 5.277±4.122 5.722±5.324 4.626±4.022 0.593 0.554 SDF2（%）30.15 33.60*33.40*4.334 0.015 SDF 改善率（%）55.0 40.0 42.5 2.081 0.353 SDF 治愈率（%）47.5 32.5 30.0 3.086 0.214

表4 3 组治疗后胚胎质量参数比较Tab.4 Three groups comparison of embryos quality after treatment

本研究中各组治疗前、后配对比较，SDF 均有显著统计学差异，分析原因在于精子膜含有高浓度的不饱和脂肪酸和低浓度的ROS 清除酶，精索静脉曲张产生的过量ROS 易诱发脂类过氧化反应，使脂肪酸失去双键，从而破坏精子膜的流动性和精子DNA 完整性，此外VC 常因其它途径导致精子生成和储存环境破坏，如温度升高、代谢毒性物质返流、镉的累积和免疫破坏等［14］，本研究各治疗措施均可不同程度改善该类患者睾丸脉络循环和精子产生微环境中的损伤因素。具体作用如下：调整良好的生活习惯包括避免抽烟、饮酒、熬夜、久坐及压力过大等，适量的运动有效促进身体机能协调和局部微环境物质的有效交换［15］；天然维生素E 含有生物活性高的D 型生育酚和生育三烯酚，可对抗生物膜上脂质过氧化所产生的自由基，保护生物膜的机构和功能［16］；迈之灵片为马栗提取物，其具有增加血管弹性和张力、抑制溶酶体活性、调节血管内皮细胞前列腺素分泌、拮抗氧自由基损伤等多作用途径，改善局部微环境、减少ROS的堆积、维持精子膜稳定性［17］。

干预后3组间精子常规参数比较差异无显著性意义，仅组间两两比较发现，迈之灵组PR 和TNPS参数稍优于空白对照组，而干预后3 组间SDF 存有显著差异，进一步分析发现迈之灵治疗组干预后SDF 显著低于另外两组，但3 组间对于SDF 的改善率和治愈率却无显著差异。分析上述结果的原因可能在于以下3 个方面：（1）3 组预处理措施的具体作用途径和原理不同，其治疗效能亦存有区别。空白对照组生活习惯改善有利于减轻VC 所致损伤，即通过改善该类患者睾丸组织局部微环境，部分程度可减少ROS 的产生、降低血管活性物质的返流，以及稳定局部免疫平衡，维生素E 则主要通过抗氧化应激途径，配合生活习惯改善后仅比空白对照组增强了抗氧化应激损伤作用，而迈之灵片可改善脉络循环和抑制溶酶体活性，配合生活习惯改善后可相对多环节降低精索静脉曲张对生殖系统的破坏作用［15-17］。（2）VC 所致SDF 的产生具体机制相对复杂，其影响因素与精子生成、成熟以及精子储存均有相关性［18］，目前临床对于SDF的治疗效果相对差于精子常规参数，各干预措施有效性差异在相对较难治疗的SDF参数方面则更易凸显。（3）3种干预措施对于SDF改善率和治愈率分别处于40%～55%和30%～47.5%水平，根据改善率和治愈率结果回顾性推算统计指标的最低样本量估算值，发现本研究纳入患者样本量不足够多，以至SDF 的改善率和治愈率两个参数的统计学差异在本研究中未能充分体现，但纳入组数量满足干预后3 组SDF 的差异分析，其显著性差异可在一定意义上表明3 种干预措施的治疗效能有别。综合考虑3种预处理的作用机制，精子漫长的生成周期和SDF 改善的相对复杂性，以及干预后SDF 的水平，初步认为叠加效应相对较强的迈之灵治疗组对SDF 的改善作用存有优势，但具体优势作用机制有待进一步阐明，且需要大样本数据进一步论证。

3 组卵子受精率和正常受精率指标方面无显著差异，原因在于卵子的受精情况与精液优化处理后精子的常规参数和卵子的成熟度相关［19］，受精前需要把精子优化处理并调整为合适精子数，两组间调整后的精子参数无显著差异，且两组患者配偶年龄、获取卵子数和成熟卵子数方面亦无显著差异，则受精率无区别。3 组胚胎早期指标卵裂率亦无区别，受精后胚胎早期发育潜能主要在于卵子的遗传调控，有基础研究发现卵母细胞中母源性表观遗传因子受精后活性增强，其可促使合子DNA 发生重编程以及合子基因组的转录激活，在促进受精后染色质的结合分离发挥重要作用，卵子特异性连接组蛋白（H1foo）在卵子发育中减数分裂的完成、受精时精子染色质的重构、早期胚胎发育过程中的基因表达、染色质表观遗传修饰等方面具有不可替代的作用［20］，现有观点多认为卵子在受精后胚胎早期发育阶段起到主导作用［21］，与本研究结论一致。本研究显示3 组间可利用胚胎率无显著差异，而优质胚胎率存有显著差异，迈之灵治疗组优质胚胎率优于另外两组，其原因在于干预后迈之灵治疗组SDF 明显低于另外两组，精子DNA 损伤对胚胎发育的影响逐渐在胚胎细胞阶段显现，SDF 异常可增加胚胎发育迟缓、胚胎碎片和胚胎非整倍体的发生率。

综上所述，轻中度VC 所致SDF 异常行不同保守干预后，SDF 指标存有显著差异，改善局部微循环的治疗方案优于单一抗氧化应激治疗，鉴于不同保守预处理对后续IVF胚胎质量的发育潜能产生差异影响，建议该类患者在行IVF 治疗前选择合适的保守预处理存有其必要性。当然，如进一步增加样本量，且增加改善局部微循环配合抗氧化应激治疗组，可能更有利于指导临床治疗方案的优化选择。