纳米羟基磷灰石通过溶酶体-线粒体通路诱导肾小管上皮细胞的凋亡机制

董文敬 张海松 徐玉晓 崔静 陈玉杰 王倩 葛坤 高燕 董文英

1河北大学附属医院（河北保定071000）；2保定市第一中心医院（河北保定071000）；3河北大学（河北保定071000）；4吉林大学（吉林吉林132000）

羟基磷灰石（HAP）是骨骼和牙齿中最重要的无机矿物成分，但并非所有的HAP 都对人体有益。在泌尿系统，由HAP 诱导形成的Randall 斑块是促进肾结石形成的重要原因［1］。在Randall 斑块中存在从大小由纳米到微米及不同形态的HAP［2］。草酸钙结石是一种最常见的肾结石，其形成机制尚未完全阐明［3］。HAP 参与草酸钙结石的形成，以及是如何促进肾结石的形成的机制研究尚未明确。

草酸钙在肾乳头Randall 斑块上的过度生长是草酸钙结石形成的潜在机制［4］。EVAN 等［5］通过肾脏活检发现，Randall 斑起源于髓袢基底膜，随后扩散到了肾直小管，最后到尿路上皮表面，促进草酸盐晶体的成核、生长和聚集，从而增加了肾结石形成的风险。在含钙结石或尿液中发现了许多磷酸钙盐成分，最常见的磷酸钙盐是HAP［6］。因此，HAP 与肾结石之间存在密切的关系，肾小管上皮细胞的氧化炎症损伤与结石的形成密切相关［7］。YU 等［8］通过将HK-2 细胞与不同浓度的HAP 和/或巨噬细胞共同培养，HAP 增加上调了HK-2 细胞中骨桥蛋白（OPN）的表达水平，并引起异质的成核、粘附和晶体沉积，从而促进了Randall 斑块和肾结石的形成。RAO 等［9］通过研究四种不同类型的HAP（球状、针状、棒状、盘状），结果表明HAP 的细胞毒性：球状＞针状＞棒状＞盘状，HAP 的物理性质对其细胞毒性起着至关重要的作用，同时发现HAP 可能激活细胞氧化应激反应，引发一系列细胞功能障碍、凋亡和坏死。本实验设计不同浓度的HAP 探究其通过氧化应激反应对HK-2 细胞的凋亡的影响及其机制，为泌尿系结石的机制研究作一定探讨。

1 材料与方法

1.1 主要试剂人源近端肾小管上皮细胞（HK-2细胞武汉普诺生命科技有限公司中国）、HAP（水热法合成、分散性好、棒状、60～100 nm×12 nm）、MEM 培养基和胎牛血清（Gibco 公司 美国）、胰蛋白酶（Sigma 公司 美国）、Annexin V-FITC/PI 细胞凋亡和坏死双染料试剂盒、活细胞/死细胞染色试剂盒和DCFH-DA（上海贝博生物有限公司中国）、青霉素和链霉素、线粒体膜电位检测试剂盒（JC-1）、吖啶橙（AO）染料（碧云天生物技术公司中国）、四甲基偶氮唑蓝（hiazoyl blue tetrazolium dromide，MTT）（Amresco 公司美国）、Lyso-Tracker Red 和Mito-Tracker Green、过氧化氢（H2O2）试剂盒（赛默飞世尔科技有限公司 中国）、Caspase-3 活性试剂盒（南京建成生物工程研究所中国）。

1.2 实验方法

1.2.1 HAP 的合成和表征根据文献，利用水热法合成了HAP［10］。将样品分散到无水乙醇中、超声均匀分散，滴于铜网，干燥，用透射电子显微镜（TEM）进行观察。将样品分散到无水乙醇中、超声均匀分散，滴于硅片，干燥，用扫描电子显微镜（SEM）进行观察。取适量的样品，用X-射线衍粉末射仪（XRD）对其结构进行测定。取适量的样品，用固态荧光测量仪对样品的荧光性质进行。

1.2.2 细胞培养将HK-2 细胞接种到含有10%FBS，100 μg/mL 青霉素和100 μg/mL 链霉素的MEM培养基上在37 ℃、5%CO2培养箱中培养，胰蛋白酶消化用于细胞繁殖，细胞同步后，实验模型分组：（1）对照组：仅添加等体积PBS 溶液（0 μg/mL）；（2）HAP 处理组：将HK-2 细胞暴露于5、10、20、40、80 μg/mL 的HAP。

含HAP 的PBS 悬液的制备：将一定量的HAP粉末铺板，用紫外线灭菌，过夜，然后分散在PBS溶液中，制备浓度为4 mg/mL 的悬浮液，并超声处理5 min。

1.2.3 HK-2 细胞存活率和活细胞/死细胞染色检测通过用MTT 的方法测定HK-2 细胞存活率［11］。将HK-2 细胞（2×104）接种到96 孔板上，按照上述分组分别孵育24、48、72 h，分别加入10 μL MTT，在37 ℃的条件下孵育4 h，弃去上清并加入100 μL DMSO，摇床震荡10 min，使用酶标仪测定570 nm 的吸光度（OD）值。细胞活性=OD实验组/OD对照组×100%。

将HK-2 细胞（1×105）接种到6 孔板上，实验模型孵育24h，严格按照活死染试剂盒说明书操作，通过荧光显微镜观察，绿色为活细胞，红色为死细胞。

1.2.4 HK-2 细胞凋亡测定Annexin V-FITC/PI 细胞凋亡和坏死双染料检测细胞凋亡［12］。将HK-2细胞（1×105）接种到6 孔板上，实验模型分为两组：（1）对照组：仅添加PBS 溶液（0 μg/mL）；（2）HAP处理组：将HK-2 细胞暴露于10、20、40 μg/mL 的HAP，孵育6、24 h，严格按照试剂盒的说明书步骤操作，通过流式细胞仪检测细胞凋亡情况。

1.2.5 HAP 在HK-2 细胞内分布分别用Lyso-Tracker Red 或Mito-Tracker Green 追踪HAP 在HK-2细胞中的细胞内分布［13］。将HK-2 细胞（2×104）接种到培养皿上，用HAP（40 μg/mL）处理HK-2 细胞6 h。用Lyso-Tracker Red 和Mito-Tracker Green分别给溶酶体和线粒体染色，用共聚焦显微镜观察HAP 在细胞中的分布。

1.2.6 ROS 的检测用DCFH-DA 检测到细胞内ROS 水平［14］。孵育6 h，将细胞用200 μL DCFHDA 染色，在37 ℃暗处孵育20 min，PBS 洗涤3 次后，PBS 重悬，通过流式细胞仪检测氧化DCFH-DA的荧光。

严格按H2O2试剂盒说明书步骤操作，使用酶标仪在415 nm 下测量吸光度。实验模型分组：（1）对照组：仅添加等体积PBS 溶液（0 μg/mL）；（2）HAP 处理组：将HK-2 细胞暴露于5、10、20、40 μg/mL 的HAP。用5 mmol/L N-乙酰半胱氨酸（NAC）预处理1 h，使用酶标仪在570 nm 下测量吸光度。细胞活性=OD实验组/OD对照组×100%。

1.2.7 溶酶体完整性检测吖啶橙（AO）检测溶酶体完整性，孵育6 h，用PBS 制备的5 μg/mL 吖啶橙染料（AO）溶液染色15 min，通过流式细胞仪检测通透性。

用Lyso-Tracker Red 检测溶酶体通透性的改变。加入Lyso-Tracker Red 和Hochest，分别孵育30 min和15 min。用荧光显微镜观察溶酶体的碱化。

1.2.8 线粒体膜电位（ΔΨm）和Caspase-3 检测将HK-2 细胞（每孔1×105个细胞）接种在6 孔板中，同2.2.4 实验模型分组，孵育6 h，收集细胞并以1 000 rpm/min 离心5 min，吸出上清液，用PBS洗涤，再次离心获得细胞沉淀，加入500 μL JC-1，在黑暗中于37 ℃孵育20 min，PBS 洗涤三次除去未反应的JC-1，并通过流式细胞仪检测分析细胞的线粒体膜电位的变化。

将HK-2 细胞（每孔1×105个细胞）接种在6 孔板中，孵育6 h，严格按照说明书裂解细胞，取少量细胞样品用BCA 蛋白浓度定量试剂盒定量蛋白浓度以保证每组的蛋白浓度在100～200 μg。Caspase-3 活性测定严格按说明书操作。用酶标仪测定波长为405 nm 的吸光度（OD）。Caspase-3 活化程度=OD样品组/OD对照组×100%。

1.3 统计学方法所有结果至少作三个独立平行实验。数据表示为均数±标准差。单因素方差分析用于多重比较，两组间比较用独立样本t检验。P＜0.05 为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 HAP 表征通过TEM 和SEM 对HAP 的形貌和大小进行测定。HAP 为分散性良好的棒状，长度×高度：（60～100）nm×12 nm（图1a、b）。利用XRD 对HAP 的结构进行测定，通过与标准衍射图（JCPDS No.09-0432 标准衍射图）对比，HAP 与标准衍射图一致，表明合成了纯的HAP（图1c）。利用固态荧光测量仪检测HAP 发蓝光（图1d）。

图1 HAP 表征结果Fig.1 HAP characterization results

2.2 HAP 对的HK-2 细胞存活率影响MTT 法观察不同剂量HAP 处理24、48 和72 h 对HK-2 细胞生存率的影响，见图2a。0、5、10、20、40和80 μg/mL的HAP 处理的HK-2 细胞在24、48 和72 h 对HK-2细胞增殖均有明显的抑制作用，并呈明显的剂量依赖性。在24 h，HAP 在5、10 μg/mL 细胞存活率无明显差异，约降低17%～19%，80 μg/mL 细胞存活率约降低60%。本结果显示，HAP 抑制HK-2 细胞增殖，降低细胞生存率且引起细胞产生细胞毒性且呈浓度-时间依赖性。

活细胞/死细胞染色结果表明HK-2 细胞增殖能力随浓度的增加而降低（图2b）HAP 在20 μg/mL后释放红色荧光的死细胞逐渐增多，释放绿色荧光的活细胞逐渐减少。HAP 在5、10 μg/mL 活/死细胞未观察到明显差异，80 μg/mL 时仅观察到了少量的活细胞。活/死细胞染色结果与MTT 结果基本一致。

2.3 HAP 引起的HK-2 细胞调亡由于80 μg/mL的HAP 明显的抑制HK-2 细胞的增殖并导致坏死脱落。结合细胞活性和活死染结果，选择0、10、20、40 μg/mL 的HAP 分别作用于HK-2 细胞共孵育6、24 h，凋亡结果表明6 h 细胞的存活率没有明显差异（图2c），24 h 凋亡结果表明细胞的凋亡和坏死率随着浓度的增加而升高（图2c、d）。

图2 HK-2 细胞凋亡结果Fig.2 Results HK-2 cell apoptosis

2.4 HAP 在HK-2 细胞中的分布见图3，HAP的蓝色荧光主要与Lyso-Tracker 标记的溶酶体的红色荧光重叠，与Mito-Tracker 标记的绿色荧光仅有部分局限，结果表明HAP 主要分布在溶酶体。

2.5 HAP 诱导HK-2 细胞ROS 的释放DCFHDA 荧光探针检测了HAP 诱导的HK-2 细胞中ROS的变化。荧光强度的定量结果表明，HK-2 细胞中的ROS 水平随浓度增加增加（图4a）。HK-2 细胞中的H2O2水平随浓度增加增加（图4b）。正常组的细胞具有暗荧光，表明细胞内ROS 水平低。HAP治疗组的绿色荧光均显着增强（图4d），表明HAP导致细胞内ROS 水平升高。乙酰半胱氨酸（NAC）是一种抗氧化剂，加入NAC，HAP 诱导的细胞活性较未加入NAC 的细胞生存率升高（图4c），表明细胞的生存率与ROS 释放有关，HAP 在5、10 μg/mL细胞存活率无明显差异。

图3 在暴露于40 μg/mL 的HAP 中6 h 后，HK-2 细胞中HAP 的分布（标尺：10 μm）Fig.3 HAP distribution in HK-2 cells after 6 hours of exposure to HAP at 40 μg/mL（Scale：10 μm）

图4 HK-2 细胞ROS 的释放Fig.4 ROS release from HK-2 cells

2.6 HAP 对HK-2 细胞溶酶体膜完整性的影响见图5a。HAP 可使HK-2 细胞溶酶体通透性增加，溶酶体内的大量的水解酶释放，溶酶体膜受损。Lyso-Tracker Red 是一种碱性染料，溶酶体红在溶酶体内的荧光强弱可间接反应溶酶体的完整性，见图5d。HAP 可使HK-2 细胞溶酶体完整性受损。结果表明HAP 可使HK-2 细胞溶酶体完整性受损，且呈浓度依赖性。

2.7 HAP 对HK-2 细胞线粒体功能的影响见图5b，所示随HAP 浓度的增加ΔΨm 降低。HAP引起的细胞内ROS 水平升高可能导致ΔΨm降低。

2.8 caspase-3 的释放caspase-3 是细胞凋亡的过程中的一种关键酶。见图5c，所示随HAP 浓度的增加caspase-3 增加。由HAP 引起的细胞ΔΨm 降低可能导致caspase-3 激活。

3 讨论

肾结石是一种日益增长的泌尿系统疾病，约占世界人口的5%～13%［15］。目前治疗肾结石的主要方法是外科手术［16］，但患者的复发率高，5年复发率约为50%［17］。因此，了解肾结石的发病机制对结石的治疗和预防复发具有重要意义。目前国内外主要集中在草酸钙在肾结石形成机制的探究［18］，而关于HAP 作为促进肾结石形成的机制的研究较少。

图5 HAP 对HK-2 细胞线粒体功能和细胞溶酶体膜完整性的影响Fig.5 Effect of HAP on mitochondrial function and lysosomal membrane integrity of HK-2 cells

近年来国内外出现了关于HAP 对肾上皮细胞损伤的报道，余骏川等［19］研究了HAP 对HK-2 细胞的损伤作用，发现细胞存活率与HAP 的浓度呈负相关且通过上调细胞内的OPN 表达参与肾结石的形成。COHENA 等［20］将草酸，草酸钙和HAP与犬肾细胞（MDCK）共培养，结果表明它们都引起MDCK 细胞中基质Gla 蛋白（MGP）表达增加，超氧化物歧化酶释放，乳酸脱氢酶释放，并促进细胞凋亡率，从而促进肾结石的形成。研究表明HAP 对肾上皮细胞造成损伤，但并未对其造成损伤的机制进一步研究。有研究表明当300 μg/mL的HAP 会对HK-2 细胞造成不可逆的损伤，造成大量细胞凋亡［21］，所以设计的最大浓度不高于200 μg/mL，本研究通过MTT 和活细胞/死细胞染色实验，发现HAP 可以降低HK-2 细胞的存活率，抑制细胞增殖，表明对HK-2 细胞具有一定的损伤作用。

研究表明细胞内的氧化应激反应能引起细胞氧化炎症损伤，过量的ROS 会引起氧化应激，导致正常的肾上皮细胞功能障碍、细胞凋亡甚至死亡［22］。目前主要凋亡途径包括线粒体和溶酶体途径［23］，ROS 是ΔΨm 降低的直接原因［24］。当细胞受损时，造成大量ROS 释放可引起线粒体功能障碍，包括ΔΨm 下降、bcl-2 的降低以及bcl-2 相关bax 蛋白的释放，同时线粒体通过释放细胞色素c进一步活化Caspase-9，Caspase-9 又可激活下游的Caspase-3，导致细胞凋亡［25］。本研究通过流式细胞仪检测HAP 可导致ΔΨm 明显降低、Caspase-3 水平增加，与ROS 的上升趋势一致。

溶酶体膜的完整性是细胞凋亡过程中的关键因素［26］，组织蛋白酶B 是一种存在于溶酶体内的凋亡介质［27］，当溶酶体膜完整性受损可导致组织蛋白酶B 释放，从而导致细胞调亡。本研究通过共聚焦显微镜观察HAP 主要分布在溶酶体内，溶酶体膜的通透性增加，组织蛋白酶B 释放，导致细胞凋亡。

综上，本研究对不同浓度的HAP 通过溶酶体-线粒体途径诱导HK-2 细胞凋亡。其机制：（1）HK-2 细胞内的ROS 释放增加导致线粒体膜电位降低，激活caspase-3 导致HK-2 细胞凋亡；（2）HAP主要定位于HK-2 细胞的溶酶体中导致溶酶体膜的通透性增加，凋亡因子释放（组织蛋白酶B）引起细胞凋亡；（3）值得注意的是HAP 作用于HK-2细胞6 h 时没有引起细胞凋亡，但有大量ROS 产生、线粒体膜电位降低、caspase-3 水平升高等改变。表明凋亡的因素的出现早于细胞的凋亡。本研究表明HAP 能明显的抑制HK-2 细胞增殖，并通过溶酶体-线粒体通径介导细胞的凋亡和坏死，从增加了结石形成的风险。