灯盏花素对H9c2心肌细胞增殖凋亡及其对ERK1/2信号通路活化的影响

袁鹰 何平 汤祥瑞 李炯侠 牟建军

1西安交通大学医学院附属三二〇一医院心血管内科（陕西汉中723000）；2西安交通大学第一附属医院（西安710061）

心脏疾病具有高致残率和高死亡率的特点，严重威胁我国居民的健康，从分子水平探讨心肌细胞的增殖和凋亡可以为心脏治疗提供理论依据［1-2］。灯盏花素（Bregenin，Bre）是从灯盏花植物中分离提取的黄酮类化合物，又称野黄芩苷（scutellarin，SCU），具有抗炎、抗凝、抗氧化、减少平滑肌细胞的迁移与增殖等作用［3］。临床多用于治疗心绞痛、冠心病及急性心肌梗死［4］。有研究结果表明，灯盏花素可能通过抑制氧化应激反应，进而减轻心肌细胞I/R 损伤，起到心肌保护作用［5］。灯盏花素作为一种非竞争性蛋白激酶C（PKC）抑制剂，可通过改善不同性质的心脏损伤，抑制心肌细胞的凋亡，发挥保护心肌的作用［6］，但具体机制尚不明确。细胞外信号调节蛋白激酶（extracellular signal-regulatedprotein kinases，ERK1/2）通路广泛参与调控心肌细胞的生长、分化与凋亡［7］，灯盏花素对缺氧心肌的保护作用是否与此有关，未见相关报道。因此本实验观察灯盏花素对缺氧H9c2心肌细胞增殖与凋亡的影响，并探讨其可能机制，以期为灯盏花素的临床应用提供实验依据。

1 材料与方法

1.1 细胞株H9c2 心肌细胞，中国科学院上海细胞研究院。

1.2 药品与试剂灯盏花素，规格：20 mg，购自中国药品生物制品检定所；胎牛血清（FBS）购自美国Hyclone-PIERCE 生物技术有限公司；胰蛋白酶、二甲亚砜（DMSO）、DMEM 培养基购自上海生物工程有限公司；MTT、ERK1/2 抑制剂PD98059 购自武汉普诺赛生命科技有限公司；鼠单克隆抗体ERK、兔抗鼠p-ERK 抗体、β-actin 抗体购自美国圣克鲁斯生物技术有限公司；BCA 蛋白定量试剂盒购自美国Gibco 公司生产；Annexinv-FITC/PI 凋亡检测试剂盒购自美国Epitmics 公司。

1.3 仪器IX73 倒置荧光显微镜，德国Eppendorf仪器有限公司生产；BD accuri C6 流式细胞仪，美国BIO-RAD 公司生产；聚丙烯酰胺垂直电泳、Labwork 凝胶图像分析系统、Labwork 凝胶图像分析系统，日本奥林巴斯光学有限公司生产；ELX-808 酶标仪，美国伯乐公司生产。

1.4 方法

1.4.1 细胞培养使用含10%FBS 的DMEM 的培养基、链霉素（100 μg/mL）和青霉素（100 μg/mL）的细胞培养液培养H9c2 心肌细胞，在37 ℃，饱和湿度，含有5% CO2的培养箱恒温培养。每2～3 d培养液更换1 次。当H9c2 心肌细胞生长到对数期时，以8×104接种到96 孔培养板上，进行分组处理培养。

1.4.2 细胞凋亡模型的建立及实验分组恒温培养24 h 后的H9c2 心肌细胞分对照组及实验组（模型组、Bre 低中高剂量组、空白ERK1/2 抑制剂组及Bre 联合ERK1/2 抑制剂组），实验组均采用终浓度为200 μmol/L 的H2O2作用6 h 建立心肌细胞缺氧模型。

对照组：使用10%的FBS 和DMSO 处理。随后各实验组分别做以下处理：模型组（H2O2）：加入终浓度为200 μmol/L 的H2O2；Bre 低剂量组（Bre 20）组：同时加入终浓度为20 μmol/L 的Bre 和200 μmol/L 的H2O2；Bre 中剂量组（Bre 40）组：同时加入终浓度为40 μmol/L 的Bre 和200 μmol/L 的H2O2；Bre 高剂量组（Bre 80 组：同时加入终浓度为80 μmol/L的Bre和200 μmol/L 的H2O2；空白ERK1/2抑制剂组（PD98059）组：终浓度为50 μmol/L 的PD98059 预处理30 min，再加入终浓度为200 μmol/L 的H2O2；Bre 联合ERK1/2 抑制剂组（Bre 80+PD98059）组：终浓度为50 μmol/L 的PD98059 预处理30 min，同时加入终浓度为80 μmol/L 的Bre和200 μmol/L 的H2O2。

1.4.3 MTT 法检测细胞的增殖率取以上不同分组处理培养48 h 后的H9c2 心肌细胞，参考文献［8］分别加入MTT 溶液20 μL（5 mg/mL），放入恒温培养箱培养4 h，弃去上清液，使用PBS 缓冲液洗涤2～3 次，每孔加入150 μL DMSO，室温下，在恒温摇床上缓慢震荡10 min 使结晶物充分溶解，使用酶联免疫检测仪在490 nm 波长处检测各组各孔的吸光度（OD值），每组取5 个平行样。细胞增殖率=OD实验孔/OD对照孔×100%。

1.4.4 Annexin V-FITC/PI 双染法检测细胞的凋亡率消化、收集以上不同分组处理培养48 h 后的H9c2 心肌细胞，参考文献［5］加入AnnexinV-FITC混匀后，再加入1～2 滴PI 染液，充分混匀后，立即采用流式细胞仪检测各组心肌细胞DNA 含量，即荧光强度值，采用MultiCycle 软件进行分析计算细胞的凋亡率。

1.4.5 Western blot 法检测ERK1/2 信号通路的磷酸化水平收集以上不同分组处理培养48 h 后的H9c2 心肌细胞，使用4 ℃预冷细胞裂解液（RIPA：PMSF=94∶6）100 μL 于冰上裂解30 min，细胞裂解液在4 ℃下12 000 r/min 离心8 min，取上清，使用BCA 蛋白试剂盒对上清液进行蛋白定量，在提取的蛋白质中加入5×SDS 凝胶上样缓冲液混匀，在沸水中煮8 min，使用SDS-PAGE 电泳对目的蛋白进行分离，湿转到硝酸纤维（PVDF）膜，5%的脱脂牛奶封闭液封闭2 h 后，加入鼠抗β-tubulin（1∶500）、鼠抗ERK1/2（1：500）、兔抗p-ERK1/2（1∶500）等一抗4 ℃孵育过夜，PBS 清洗3 次，每次5 min，然后分别加入辣根过氧化物酶标记的山羊抗兔二抗（1∶1 500），37 ℃孵育1 h，再使用PBS 洗膜3 次，每次10 min，用超敏ECL 化学发光显影法进行曝光显影，使用AlphaImager 2200 凝胶图像分析系统分析胶片的光密度值。灰度比值=蛋白条带灰度/内参照蛋白条带灰度。

1.5 统计学方法所有实验数据均采用SPSS 21.0 统计软件分析处理，计量资料以均数±标准差表示，多组间比较采用单因素ANOVA 分析，两两比较采用LSD-t检验，以P＜0.05 为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 灯盏花素对H9c2 心肌细胞增殖的影响与Control 组相比，经H2O2处理后的心肌细胞的增殖率降低，且差异有统计学意义（P＜0.01），但经过在20～80 μmol/L Bre 各浓度组的干预后，明显促进了H9c2 心肌细胞的增殖，且随着浓度的增加H9c2 心肌细胞的增殖率升高（P＜0.01）。与H2O2组比较，加入ERK1/2 抑制剂PD98059 的各组细胞增殖率差异无统计学意义（P＞0.05）。与Bre 各剂量组相比，加入ERK1/2 抑制剂PD98059 的H9c2 心肌细胞的增殖率显著下降（P＜0.01）。与Bre 80+PD98059 比较，PD98059 组中的心肌细胞的增殖率差异无统计学意义（P＞0.05）。见表1。

2.2 灯盏花素对H9c2 心肌细胞凋亡的影响与Control 组相比，经H2O2处理后的心肌细胞的凋亡率升高，且差异有统计学意义（P＜0.01），经过在20～80 μmol/L Bre 各浓度组干预后的H9c2 心肌细胞的凋亡率随着浓度的增加降低（P＜0.01）。与H2O2组比较，加入ERK1/2 抑制剂PD98059 的各组心肌细胞的凋亡率差异无统计学意义（P＞0.05）。与Bre 各剂量组比较，加入ERK1/2 抑制剂PD98059 的各组细胞的凋亡率显著上升（P＜0.01）。但PD98059 与Bre 80+PD98059 组之间的心肌细胞的凋亡率差异无统计学意义（P＞0.05）。见表2。

表1 各实验组对H9c2 心肌细胞增殖率的影响Tab 1 Effect of each experimental group on the proliferation rate of H9c2 cardiomyocytes ±s

表1 各实验组对H9c2 心肌细胞增殖率的影响Tab 1 Effect of each experimental group on the proliferation rate of H9c2 cardiomyocytes ±s

注：与对照组比较，**P＜0.01；与H2O2模型组比较，##P＜0.01；与Bre 20 组比较，ΔΔP＜0.01；与Bre 40 组比较，▲▲P＜0.01；Bre 80组比较，※P＜0.01

分组对照组H2O2模型组Bre 20 Bre 40 Bre 80 Bre 80+PD98059 PD98059例数6 6 6 6 6 6 6增殖率(%)99.87±0.22 65.37±4.52**73.76±6.23**##81.25±5.16**##ΔΔ 92.52±6.63**##ΔΔ▲▲67.09±3.81**ΔΔ▲▲※※66.82±4.33**ΔΔ▲▲※※

表2 各实验组对H9c2 心肌细胞凋亡率的影响Tab.2 Effect of each experimental group on the apoptosis rate of H9c2 cardiomyocytes ±s

表2 各实验组对H9c2 心肌细胞凋亡率的影响Tab.2 Effect of each experimental group on the apoptosis rate of H9c2 cardiomyocytes ±s

注：与对照组比较，**P＜0.01；与H2O2模型组比较，##P＜0.01；与Bre 20 组比较，ΔΔP＜0.01；与Bre 40 组比较，▲▲P＜0.01；Bre 80组比较，※P＜0.01

分组对照组H2O2模型组Bre 20 Bre 40 Bre 80 Bre 80+PD98059 PD98059例数6 6 6 6 6 6 6凋亡率（%）6.26±0.17 72.57±2.12**59.36±2.85**##51.29±2.03**##ΔΔ 30.71±1.39**##ΔΔ▲▲71.22±3.63**##ΔΔ▲▲※※70.56±2.91**ΔΔ▲▲※※

2.3 灯盏花素对H9c2 心肌细胞中ERK1/2 信号通路的磷酸化水平的影响从实验结果看，与Control 组相比，其他各组的p-ERK1/2 蛋白表达均显著增加（P＜0.05 或P＜0.01）；与H2O2组比较，Bre 各浓度组中p-ERK1/2 蛋白表达量均显著增加（P＜0.01），且随着浓度的增加p-ERK1/2 蛋白表达量上升（P＜0.01）。与Bre 各浓度组比较，经过ERK1/2抑制剂PD98059 处理后的Bre 80+PD98059、PD98059 两组细胞中，p-ERK1/2 蛋白的表达被显著抑制（P＜0.01）。各组间ERK1/2 蛋白表达量差异无统计学意义（P＞0.05），见图1-3。

图1 Western blot 检测H9c2 心肌细胞ERK1/2 信号通路相关蛋白的表达Fig.1 Western blot analysis of ERK1/2 signaling pathwayrelated protein expression in H9c2 cardiomyocytes

图2 各实验组ERK1/2 蛋白的相对表达量Fig.2 Relative expression levels of ERK1/2 protein in each experimental group

图3 各实验组p-ERK1/2 蛋白的相对表达量Fig.3 Relative expression levels of p-ERK1/2 protein in each experimental group

3 讨论

心血管疾病是一种严重威胁50 岁以上中老年人健康的常见病，约50%的心血管患者生活不能完全自理，我国每年死于心血管疾病的人数高达300 万人，居各种死因首位［9-10］。心肌细胞的凋亡在各种心脏疾病的发生与发展中起着重要作用［11］。目前，关于心肌细胞凋亡和增殖的分子机制是当前临床研究的热点。

灯盏花素属于黄酮类化合物，可通过抑制凋亡发挥对不同类型的心脑损伤的保护作用［12-13］。研究显示，灯盏花素可通过调节PI3K/Akt/eNOS 信号通路及抑制氧化应激反应，有效抑制缺血再灌注大鼠诱导的心肌细胞凋亡［14］。但灯盏花素是否能有效改善缺氧环境下的心肌细胞凋亡，未见相关报道。本研究表明，灯盏花素显著提高了缺氧H9c2 心肌细胞的增殖率，并显著降低了缺氧心肌细胞的凋亡率，且呈现明显的浓度依赖性，结果提示，灯盏花素能有效促进在缺氧环境中心肌细胞的增殖，缓解因缺氧诱导的心肌细胞凋亡。

促有丝分裂原活化蛋白激酶（Mitogen-activatedprotein kinases，MAPK）是细胞内的一组丝/苏氨酸蛋白激酶家族，能将细胞信号传递到细胞核，具有促进凋亡与促进增殖的双重调控作用［15-16］。ERK1/2 是MAPK 家族中的重要亚族之一，在细胞的生长、分化和增殖等多种病理生理过程中起着重要的调控作用［17-18］。研究显示，姜黄素烟酸酯可能通过下调p-ERK1/2、CyclinD1 蛋白的表达而明显抑制血管平滑肌细胞增殖［19］；瓜蒌皮提取物可通过激活ERK1/2 和PI3K/Akt 转导通路，阻止由H2O2诱导的H9c2 细胞损伤而起到保护作用［20］。在本研究中，灯盏花素显著上调了H9c2 缺氧心肌细胞中p-ERK1/2 的表达，并呈现浓度依赖性，同时经过ERK1/2 抑制剂PD98059 的干预后，其H9c2 缺氧心肌细胞存活率明显降低，凋亡率显著升高，并且p-ERK1/2 蛋白的表达量显著降低。结果提示，灯盏花素可激活H9c2 缺氧心肌细胞中ERK1/2 信号通路相关蛋白的表达。

综上所述，灯盏花素可增加H9c2 缺氧心肌细胞的增殖，并降低H9c2 缺氧细胞的凋亡，其机制可能与活化ERK1/2 信号通路有关。