基于Calpain-ERK信号通路研究Calpeptin对雌激素诱导人乳腺上皮细胞MCF-10A转化及干性标志物表达的影响

张艳 王旭东 金爱 何艳 詹云惠 沈敬堃 董宇华 宛蕾

摘 要 目的：研究钙激活中性蛋白酶（Calpain）抑制剂Calpeptin对雌二醇（E2）诱导人乳腺上皮细胞MCF-10A转化及干性标志物表达的影响，并探讨其作用机制。方法：以人乳腺上皮细胞MCF-10A为研究对象，采用E2诱导制备转化细胞模型。将细胞分为对照组[0.1%二甲基亚砜（DMSO）]、E2转化组（50 nmol/L）、E2转化+Calpeptin组（50 nmol/L E2+1 μmol/L Calpeptin），以相应含药培养基连续培养15代。然后采用MTT法检测细胞的增殖率（24、48 h），采用平板克隆试验检测细胞的克隆形成率，采用悬浮成球试验检测细胞的成球数;采用实时荧光定量-聚合酶链式反应法检测细胞中干性标志物（CD44、Nanog、OCT4）和细胞外信号调节激酶（ERK）mRNA表达水平，并采用Western blotting法检测细胞中CD44、Nanog、OCT4、ERK和磷酸化ERK（p-ERK）蛋白表达水平。另取E2转化细胞分为对照组（0.1%DMSO）和U0126（ERK抑制剂）组（10 μmol/L），按上述方法测定细胞的克隆形成率、成球数以及细胞中CD44、Nanog、OCT4、p-ERK蛋白表达水平，以验证ERK表达抑制与转化细胞生物学行为及干性标志物表达之间的关系。结果：与对照组比较，E2转化组细胞的增殖率（24、48 h）、克隆形成率均显著升高（P<0.01），细胞成球数均显著增加（P<0.01），细胞中CD44、Nanog、OCT4、p-ERK mRNA表达水平及CD44、Nanog、OCT4、p-ERK蛋白表达水平均显著升高（P<0.01）。与E2转化组比较，E2转化+Calpeptin组细胞的增殖率（24、48 h）、克隆形成率均显著降低（P<0.01），细胞成球数显著减少（P<0.05），细胞中CD44、Nanog、OCT4、ERK mRNA表达水平及CD44、Nanog、OCT4、p-ERK蛋白表达水平均显著降低（P<0.05或P<0.01）。加入ERK抑制剂U0126后，E2转化细胞的克隆形成率、成球数以及细胞中p-ERK、CD44、Nanog、OCT4蛋白表达水平均显著增加或升高（P<0.05或P<0.01）。结论：Calpeptin可抑制E2诱导的人乳腺上皮细胞MCF-10A转化及干性标志物表达，其機制可能与抑制Calpain-ERK信号通路的激活有关。

关键词 Calpeptin;雌二醇;人乳腺上皮细胞MCF-10A;细胞转化;干性标志物;细胞外信号调节激酶;机制

ABSTRACT   OBJECTIVE： To study the effects of Calpeptin inhibitor Calpeptin on the transformation and stemness markers expression induced by estradiol （E2）， and to investigate its mechanism. METHODS： Taking human mammary epithelial cells MCF-10A as research object， transformed cells were induced by E2 treatment. Cells were divided into control group（0.1%DMSO）， E2-transformed group （50 nmol/L）， E2-transformed+Calpeptin group （50 nmol/L E2+1 μmol/L Calpeptin）， then continuously treated with corresponding drug-containing culture medium for 15 generations. Then， MTT assay was used to determine the proliferation rate of cells （24，48 h）; plate colony test was used to detect the Clone formation rate of cells; the number of sphere-forming cells was measured by suspension spheroidization test;mRNA expressions of stemness marker （CD44， Nanog， OCT4） and extracellular sigal-regulated kinase （ERK） were detected by RT-qPCR，and protein expressions of CD44， Nanog， OCT4 ， ERK and p-ERK were detected by Western blotting assay. Another E2-transformed cells were divided into control group （0.1%DMSO） and U0126 （ERK inhibitor） group （10 μmol/L）. Clone formation rate， the number of sphere-forming， protein expressions of CD44， Nanog， OCT4，ERK and p-ERK were determined with above methods， and to validate the relationship of ERK inhibition with transformed cell behavior and the expression of stemness markers. RESULTS：Compared with control group， proliferation rate and clone formation rate of E2 transformed group were increased significantly （P<0.01）， and the number of sphere-forming was increased significantly （P<0.01）; mRNA expression levels of CD44， Nanog， OCT4，ERK and protein expression levels of CD44， Nanog， OCT4 and p-ERK in cells were increased significantly （P<0.01）. Compared with E2-transformed group， proliferation rate （24， 48 h） and clone formation rate of E2-transformed+Calpeptin group were decreased significantly （P<0.01）， and the number of sphere-forming was decreased significantly （P<0.05）; mRNA expression levels of CD44， Nanog， OCT4 ， ERK and protein expression levels of CD44， Nanog， OCT4， p-ERK in cells were decreased significantly （P<0.05 or P<0.01）. After treated with ERK inhibitor U0126， clone formation rate of E2-transformed cells， the number of sphere-forming， protein expression levels of CD44， Nanog， OCT4 and p-ERK were increased significantly （P<0.05 or P<0.01）. CONCLUSIONS： Calpeptin can inhibit the transformation and the expression of stemness markers of human mammary epithelial cells MCF-10A， and the mechanism of it may be associated with inhibiting the activation of Calpain-ERK signaling pathway.

KEYWORDS   Calpeptin; Estradiol; Human mammary epithelial cells MCF-10A; Cell transformation; Stemness marker; Extracellular sigal-regulated kinase; Mechanism

雌二醇（E2）是诱导乳腺癌发生的主要风险因素[1]，其可通过激活雌激素受体（ER）或代谢产生有毒代谢产物，从而诱导乳腺上皮细胞转化以及癌变发生[2-3]。相关研究显示，乳腺肿瘤干细胞（BCSCs）在乳腺癌的发生、维持、转移、治疗抵抗和復发中起着重要作用，而E2与BCSCs的产生密切相关[4]。人乳腺上皮细胞MCF-10A是一种非致瘤性乳腺上皮细胞，正常情况下其呈不规则多边形贴壁生长，且增殖缓慢;但经E2长期诱导后，MCF-10A细胞将失去上皮细胞相关特性，胞体变大，呈长梭形贴壁生长，增殖能力增强，且具有一定的间质特征[5]。近期有研究发现，E2能诱导人乳腺上皮细胞MCF-10A的自我更新、多潜能分化等干性特征增强，促进该细胞向BCSCs转化[6]。

钙激活中性蛋白酶（Calcium-activated neutral protease，缩写为“Calpain”）是一种Ca2+依赖型半胱氨酸蛋白酶，主要成员有Calpain-1和Calpain-2，可参与调控乳腺癌细胞的多种恶性生物学行为[7-8]。Calpeptin是一种具有细胞穿透性的Calpain抑制剂，据相关研究报道，Calpeptin可通过抑制ER阳性乳腺癌细胞MCF-7中Calpain的活性，从而抑制细胞的迁移和侵袭[9]。本课题组前期研究发现，在E2诱导人乳腺上皮细胞MCF-10A转化的过程中，通常伴随着Calpain活性的增强[10]。而Calpain活性增强在癌症的发生发展中具有重要作用，其参与介导了上皮细胞转化以及癌细胞的迁移、增殖[10-12]。但有关Calpain是否介导了E2诱导的乳腺上皮细胞MCF-10A干性特征增强，尚未见文献报道。另有研究显示，细胞外信号调节激酶（ERK）信号通路的激活与细胞的恶性转化密切相关[13]。但Calpeptin是否能通过ERK通路干预乳腺上皮细胞MCF-10A转化以及干性特征增强，也同样尚未见文献报道。鉴于此，本研究旨在通过探讨Calpain抑制剂Calpeptin对E2诱导乳腺上皮细胞MCF-10A转化及干性标志物（CD44、OCT4、Nanog）表达的影响，并通过探究Calpain-ERK信号通路在其中的介导作用，为阐明Calpeptin抑制E2诱导乳腺癌发生的作用机制提供参考。

1 材料

1.1 仪器

ND2000型超微量紫外分光光度计、2001HY-6003型CO2细胞培养箱（美国Thermo Fisher Scientific公司）;HH-W21-Cr600型电热恒温水温箱、DW-86L486型立式超低温冰箱（青岛海尔特种电器有限公司）;SW-CJ-2D型超净工作台（苏州净化设备有限公司）;FA2204N型电子天平（上海菁海仪器有限公司）;ZHWY-103D型恒温培养振荡器（上海智城分析仪器制造有限公司）;DYY-7C型电泳仪（北京市六一仪器厂）;Epoch型全波长酶标仪（美国Bio-Tek公司）;CKX41型倒置显微镜（日本Olympus公司）;TI-U-DS-RI2型倒置荧光显微镜（日本Nikon公司）;Centrifuge 5810R型高速冷冻离心机（德国Eppendorf公司）;TS-8型转移脱色摇床、VORTEX-5型涡旋振荡仪（海门市其林贝尔仪器制造有限公司）;Step One PlusTM型实时荧光定量-聚合酶链式反应（PCR）仪（美国Applied Biosystems公司）。

1.2 药品与试剂

E2标准品（批号：WXBC5362V，纯度：>98%）、Calpeptin（批号：C8999，纯度：>98%）、氢化可的松标准品（批号：PHR1014，纯度：100%）、霍乱毒素（批号：C8052，纯度：95%）均购自美国Sigma公司;U0126（ERK抑制剂，美国Med Chem Express公司，批号：HY-12031，纯度：>98%）;马血清、0.25%胰蛋白酶、B-27添加物（50×）（美国Gibco公司，批号分别为：1893656、2046777、2046964）;表皮生长因子（ EGF，美国PeproTech公司，批号：0515AFC05）;成纤维细胞生长因子（FGFB，中国近岸蛋白质科技有限公司，批号：0331504）;重组人胰岛素（上海翊圣生物科技有限公司，批号：11820131，含量：95%～105%）;磷酸盐缓冲液（PBS）粉末、1%结晶紫染色液、5×蛋白质上样缓冲液、十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE）制备试剂盒、高效RIPA组织/快速裂解液、膜再生液（北京索莱宝科技有限公司，批号分别为：1022Q021、20180627、20190328、20191104、20190711、20190715）;青链霉素、DMEM/F12培养基（美国 Hyclone 公司，批号分别为：J150038、AE28870264）;二喹啉甲酸（BCA）蛋白浓度试剂盒（美国Thermo Fisher Scientific公司，批号：UD277257）;MTT试剂盒（北京博奥拓科技有限公司，批号：298-93-1）;Trizol试剂（美国Ambion Life Technologies公司，批号：149002）;反转录试剂盒PrimeScriptTM RT reagent Kit、PCR反应试剂SYBR? Premix Ex TaqTM Ⅱ（日本Takara公司，批号分别为：AK6301、AIG2363A）;CD44小鼠单克隆抗体、ERK兔多克隆抗体（美国Cell Signaling Technolog公司，批号分别为：3570S、4695S）;Nanog、OCT4兔单克隆抗体（美国Abcam公司，批号分别为：ab109250、ab109183）;磷酸化ERK（p-ERK）小鼠多克隆抗体（美国Santa Cruz公司，批号：SC-7383）;α-微管蛋白（α-tubulin）兔多克隆抗体、甘油醛-3-磷酸脱氢酶（GAPDH）鼠单克隆抗体、辣根过氧化物酶标记的山羊抗兔免疫球蛋白G（IgG）二抗、辣根过氧化物酶标记的山羊抗鼠 IgG二抗（美国 Bioworld 公司，批号分别为：BS1699、MB001、BS13278、BS12478）;甲醇、二甲基亚砜（DMSO）、乙醇等均为分析纯，水为双蒸水。CD44、Nanog、OCT4、ERK和GAPDH引物均由生工生物工程（上海）股份有限公司合成。

1.3 细胞

人乳腺上皮细胞MCF-10A由陆军军医大学生物化学教研室馈赠。

2 方法

2.1 细胞培养

将人乳腺上皮细胞MCF-10A培养于DMEM/F12全培养基中（含有10%马血清、10 ng/mL霍乱毒素、50    ng/mL氢化可的松、10 μg/mL胰岛素、20 ng/mL EGF以及1%青链霉素，下同），在37 ℃、5%CO2的培养箱（后文条件相同）中进行培养，每48 h更换1次培养液。

2.2 細胞转化试验

将乳腺上皮细胞MCF-10A随机分为对照组、E2转化组（DMSO终体积分数为0.1%，下同）和E2转化+Calpeptin组（DMSO终体积分数为0.1%，下同）。3组细胞分别以0.1%DMSO、E2（50 nmol/L）、E2（50 nmol/L）+Calpeptin（1 μmol/L）连续处理15代，每次传代时均加入相应药物处理，然后按照“2.1”项下条件进行培养，观察细胞形态变化并拍照。细胞转化标志：细胞形态发生变化（细胞胞体变大，胞内出现黑色颗粒，排列紊乱，呈长梭形贴壁生长，具有一定的间质细胞样特性），生长加速，克隆形成能力增强[5]。

2.3 MTT试验检测细胞的增殖能力

取“2.2”项下3组对数生长期细胞，分别用0.25%胰蛋白酶消化后，以1 000 r/min离心5 min，用DMEM/F12全培养基重悬并调整各组细胞密度至4×104个/mL，然后接种于96孔板中，每孔200 μL，每组设置5个复孔。另外设置不加细胞只加培养基的调零孔。将培养板置于培养箱中培养至细胞贴壁，吸弃培养液，每孔中加入200 μL不含血清的DMEM/F12培养基，继续培养24、48 h后，每孔中均避光加入5%MTT试液20 μL，混匀，培养3 h后，终止培养;弃去培养基，加入150 μL DMSO溶液，低速振荡10 min。使用酶标仪于490 nm波长下测定各孔吸光度（OD），计算细胞增殖率。细胞增殖率（%）=（给药组OD值-调零孔OD值）/（对照组OD值-调零孔OD值）×100%。试验重复3次。

2.4 平板克隆试验检测细胞的克隆形成能力

取“2.2”项下3组对数生长期细胞，分别按400个/孔接种于6孔板中，每组设置3个复孔。每孔中加入4 mL DMEM/F12全培养基，于培养箱中培养14 d;弃去培养液，以PBS洗涤3次，加入4%多聚甲醛溶液固定30 min;以0.1%结晶紫染色30 min后，洗去染色液，常温晾干。用相机拍照并观察其克隆集落形成情况，使用Image J 1.8.0软件对克隆集落进行计数，并计算其克隆形成率。克隆形成率（%）=（克隆集落形成数/接种细胞总数）×100%。试验重复3次。

2.5 悬浮成球试验检测细胞的自我更新能力

取“2.2”项下3组处于对数生长期细胞，分别按       5 000个/孔接种于24孔超低黏附板中，每组设置3个复孔。每孔中加入2 mL悬浮成球试验培养基（含5 μg/mL胰岛素、2%B-27添加物、20 ng/mL EGF、20 ng/mL FGFB、1 μg/mL氢化可的松和1%青链霉素的DMEM/F12培养基），在培养箱中培养10 d后，于显微镜下拍照并对每组的成球情况进行计数。试验重复3次。

2.6 实时荧光定量-PCR试验检测细胞中CD44、Nanog、OCT4、ERK mRNA的表达情况

取“2.2”项下3组对数生长期细胞，分别按2×105个/孔接种于6孔板中，每组设置2个复孔。待细胞贴壁后，以DMEM/F12培养基（不含血清）于培养箱中培养48 h。按照Trizol说明书方法操作，分离提取细胞中的总RNA，用超微量分光光度计测定各组RNA浓度。使用PrimeScriptTM RT reagent Kit试剂盒并按说明书方法操作，将1 μg总RNA逆转录为cDNA，并以cDNA为模板进行PCR扩增。反应体系：cDNA模板2 μL，上、下游引物各0.8 μL，SYBR? Premix Ex TaqTM Ⅱ 10.4 μL、无酶水6 μL，总体系为20 μL。反应条件：95 ℃预变性30 s;95 ℃变性3 s，60 ℃退火30 s，72 ℃延伸30 s，共40个循环。以GAPDH为内参，采用2-ΔΔct法计算CD44、Nanog、OCT4和ERK mRNA的表达水平（其中ct表示每个反应管内的荧光信号达到设定阈值时所经历的循环次数）。试验重复3次。引物序列及扩增产物长度见表1。

2.7 Western bloting试验检测细胞中CD44、Nanog、OCT4、ERK和p-ERK蛋白的表达情况

取“2.2”项下3组对数生长期细胞，分别按“2.6”项下方法进行细胞接种、培养，然后以RIPA蛋白裂解液提取总蛋白，再以BCA法进行蛋白定量后进行制样。蛋白样品在80 V电压下电泳30 min后，调节电压至120 V继续电泳1 h;然后以电流300 mA转膜[聚偏氟乙烯（PVDF）膜]1.5 h，以5%脱脂奶粉室温封闭1 h;分别加入稀释比例均为1 ∶ 1 000的CD44、Nanog、OCT4、ERK、p-ERK一抗和稀释比例为1 ∶ 10 000的GAPDH一抗，4 ℃下孵育过夜;以1×TBST溶液洗膜3次，每次10 min;加入相应二抗（稀释比例均为1 ∶ 10 000），室温下孵育1 h;以1×TBST溶液洗膜3次，每次10 min，再用ECL发光试剂盒显色。以凝胶成像系统成像，并用Image J 1.8.0软件分析，以目的蛋白条带灰度值与内参GAPDH蛋白条带灰度值的比值表示目的蛋白的表达水平。试验重复3次。

2.8 U0126抑制ERK蛋白表达后对E2转化细胞克隆形成能力、自我更新能力以及干性标志物表达的影响

取对数生长期的E2转化细胞，随机分为对照组（含0.1%DMSO）和U0126（ERK抑制剂）组（10 μmol/L）。分别按“2.4”项下方法检测细胞的克隆形成能力，按“2.5”项下方法检测细胞自我更新能力，按“2.7”项下方法检测细胞中CD44、Nanog、OCT4和p-ERK蛋白的表达情况（以α-tubulin为内参，稀释比例为1 ∶ 10 000）。试验均重复3次。

2.9 统计学方法

采用SPSS 11.5软件对数据进行统计处理和分析。数据以x±s表示。多组间比较采用单因素方差分析，两独立样本组间比较采用t检验。P<0.05表示差异具有统计学意义。

3 结果

3.1 Calpeptin对E2转化细胞形态学特征的影响

细胞形态学观察发现，与对照组比较，E2转化组细胞形态发生了明显变化，细胞呈长梭形贴壁生长，细胞体积变大，具有一定的间质细胞样特征;E2转化+Calpeptin组细胞形态与对照组接近。各组细胞形态学特征显微图见图1。

3.2 Calpeptin对E2转化细胞增殖能力的影响

培养24、48 h后，与对照组比较，E2转化组细胞的增殖率均显著升高（P<0.01）;与E2转化组比较，E2转化+Calpeptin组细胞的增殖率均显著降低（P<0.01）。各组细胞增殖率测定结果见表2。

3.3 Calpeptin对E2转化细胞克隆形成能力的影响

与对照组比较，E2转化组细胞的克隆形成率显著升高（P<0.01）;与E2转化组比较，E2转化+Calpeptin组细胞的克隆形成率显著降低（P<0.01）。各组细胞克隆形成情况平板图见图2，克隆形成率测定结果见表3。

3.4 Calpeptin对E2转化细胞自我更新能力的影响

与对照组比较，E2转化组细胞的成球数显著增加（P<0.01）;与E2转化组比较，E2转化+Calpeptin组细胞的成球数显著减少（P<0.05）。各组细胞成球情况显微图见图3，成球数测定结果表4。

3.5 Calpeptin对E2转化细胞中CD44、Nanog、OCT4、ERK mRNA表达的影响

与对照组比较，E2转化组细胞中CD44、Nanog、OCT4、ERK mRNA的表达水平均显著升高（P<0.01）;与E2转化组比较，E2转化+Calpeptin组细胞中CD44、Nanog、OCT4、ERK mRNA的表达水平均显著降低（P<0.05或P<0.01）。各组细胞中4种标志物mRNA表达水平测定结果见表5。

3.6 Calpeptin对E2转化细胞中CD44、Nanog、OCT4、ERK和p-ERK蛋白表达的影响

与对照组比较，E2转化组细胞中CD44、Nanog、OCT4和p-ERK蛋白的表达水平均显著升高（P<0.01）;与E2转化组比較，E2转化+Calpeptin组细胞中CD44、Nanog、OCT4、p-ERK蛋白的表达水平均显著降低（P<0.05或P<0.01）;3组细胞中ERK蛋白表达水平间比较，差异均无统计学意义（P>0.05）。各组细胞中CD44、Nanog、OCT4、ERK、p-ERK蛋白表达电泳图见图4，蛋白表达水平测定结果见表6。

3.7 ERK表达被抑制后对E2转化细胞的克隆形成能力、自我更新能力以及干性相关蛋白表达的影响

与对照组比较，U0126组中p-ERK蛋白表达水平显著降低（P<0.05），表明ERK蛋白表达被抑制;细胞的克隆形成率显著降低（P<0.01），成球数显著减少（P<0.05），干性相关蛋白（CD44、Nanog、OCT4）的表达水平也显著降低（P<0.05）。这提示抑制ERK表达后，E2转化细胞的克隆形成能力、自我更新能力以及干性相关蛋白的表达均减弱。ERK抑制剂U0126作用下各组细胞中ERK、p-ERK蛋白和干性相关蛋白表达测定结果见图5、表7，细胞克隆形成和细胞成球情况测定结果见图6、表8。

4 讨论

乳腺上皮细胞发生转化是乳腺癌发生的必要过程。肿瘤干细胞是细胞内具有自我更新、多潜能分化和肿瘤特殊生物学行为的一类细胞亚群，与癌症的发生发展密切相关[14]。近期有研究显示，E2可以促进乳腺上皮细胞MCF-10A获得干细胞特性[6]。CD44、Nanog和OCT4均是公认的癌症干细胞标志物。据报道，CD44可通过与细胞外基质成分、生长因子和细胞因子相互作用来促进肿瘤的发生[15]。而Nanog和OCT4在多种癌症干细胞中都呈异常高表达状态，其高表达后能够促进细胞的重新编程，从而调控肿瘤细胞增殖、自我更新和多能性分化等干细胞特征[16-17]。本研究采用E2连续培养乳腺上皮细胞MCF-10A 15代，发现E2处理后细胞出现了一定的间质细胞样特征，细胞活力、克隆形成能力以及自我更新能力均显著增强，这表明细胞在E2作用下发生了转化。同时，E2转化细胞中干性标志物CD44、Nanog、OCT4 mRNA及其蛋白的表达均显著上调，这提示E2不仅可诱导细胞转化，还可增强转化细胞的干性特征。

Calpain的生物学活性与肿瘤的发生有关，其可通过修饰性剪切多种肿瘤抑制蛋白，促进上皮细胞的转化[18-19]。Calpain抑制剂Calpeptin是一种具有细胞渗透性的特异性抑制剂。据相关文献报道，Calpeptin在1～10 μmol/L浓度范围内能显著抑制E2诱导的人乳腺癌细胞MCF-7的增殖[20]。本课题组前期研究也发现，10        μmol/L Calpeptin能显著抑制E2诱导的MCF-10A转化细胞的增殖[21]。故在本次研究的预试验中，笔者先是以1、5、10 μmol/L Calpeptin联合E2连续处理细胞MCF-10A 15代。结果发现，在5、10 μmol/L Calpeptin的作用下细胞逐渐凋亡，只有在1 μmol/L浓度下细胞能够正常生长，同时能显著抑制E2诱导的细胞转化。所以，在本次探讨Calpeptin对E2诱导人乳腺上皮细胞MCF-10A转化和干性特征的影响机制研究中，笔者选择1 μmol/L为干预浓度。结果发现，该浓度下Calpeptin 可抑制E2诱导乳腺上皮细胞MCF-10A的转化和干性特征的增强，这提示Calpain可能参与介导了E2诱导的细胞转化和干性特征增强。

当ERK信号通路被激活时，非活性ERK被磷酸化为活化形式的p-ERK，并由细胞质转移至细胞核内，转录激活核内的转录因子，进而促进细胞增殖、分化以及癌症发生[22]。有研究显示，ERK信号通路的激活与乳腺癌[23-24]、肺癌[25-26]、甲状腺癌[27]等癌症细胞的增殖、迁移以及干细胞特性增强相关。本研究结果显示，E2转化组细胞可高表达ERK mRNA和p-ERK蛋白，但E2转化+Calpeptin组细胞ERK mRNA和p-ERK蛋白的表达明显下调，这提示Calpeptin抑制E2诱导的细胞转化以及干性标志物表达的作用可能与抑制ERK信号通路的激活有关。为了验证以上结论，笔者进一步以ERK特异性抑制剂U0126处理E2转化细胞。结果发现，经U0126处理后，细胞的增殖能力和自我更新能力均显著减弱，干性相关蛋白的表达也显著下调，这进一步说明ERK信号通路可能参与介导了E2诱导乳腺上皮细胞MCF-10A转化及其干性增强。有文献报道，E2可通过激活Calpain-ERK信号通路促进ER阳性乳腺癌细胞的增殖[28]。但本研究发现，Calpain抑制剂Calpeptin在抑制E2诱导细胞转化的同时，能显著下调E2诱导的p-ERK蛋白的表达。由此推测，细胞内可能存在Calpain-ERK的正反馈环路，后者在E2作用下被激活，促进Calpain活性增强，从而参与诱导细胞转化及其干性增强;而当Calpain活性被抑制时，可能反馈性调节ERK的磷酸化作用，抑制了ERK的磷酸化，从而抑制细胞转化以及干性增强。

综上所述，Calpeptin能抑制E2诱导的人乳腺上皮细胞MCF-10A转化及干性标志物的表达，其机制可能与抑制Calpain-ERK信号通路的激活有关，但其具体作用靶点和机制有待后续研究进一步确证。

參考文献

[ 1 ] WEN C，WU L，FU L，et al. Unifying mechanism in the initiation of breast cancer by metabolism of estrogen：review[J]. Mol Med Rep，2017，16（2）：1001-1006.

[ 2 ] CHEN JQ，RUSSO PA，COOKE C，et al. ERβ shifts from mitochondria to nucleus during estrogen-induced neoplastic transformation of human breast epithelial cells and is involved in estrogen-induced synthesis of mitochondrial respiratory chain proteins[J]. Biochim Biophys Acta，2007，1773（12）：1732-1746.

[ 3 ] SAMAVAT H，KURZAR MS. Estrogen metabolism and breast cancer[J]. Cancer Lett，2015，356（200）：231-243.

[ 4 ] VOUTSADAKIS IA. HER2 in stemness and epithelial- mesenchymal plasticity of breast cancer[J]. Clin Transl Oncol，2019，21（5）：539-555.

[ 5 ] 杨莉，李阳，朱筑霞，等. FAK在雌激素诱导MCF-10A乳腺上皮细胞转化中的表达及其意义[J].重庆医学，2013，42（20）：2376-2377.

[ 6 ] DAS JK，FELTY Q，POPPITI R，et al. Nuclear respiratory factor 1 acting as an oncoprotein drives estrogen-induced breast carcinogenesis[J]. Cells，2018，7（12）：234-256.

[ 7 ] HOSKIN V，SZETO A，GHAFFARI A，et al. Ezrin regulates focal adhesion and invadopodia dynamics by altering calpain activity to promote breast cancer cell invasion[J]. Mol Biol Cell，2015，26（19）：3464-3479.

[ 8 ] STORR SJ，THOMPSON N，PU X，et al. Calpain in breast cancer：role in disease progression and treatment respone[J]. Pathobiology，2015，82（3/4）：133-141.

[ 9 ] LI CL，YANG D，CAO X，et al. Fibronectin induces epithelial-mesenchymal transition in human breast cancer MCF-7 cells via activation of calpain[J]. Oncol Lett，2017，13（5）：3889-3895.

[10] 杨莉，朱筑霞，刘晓红，等.钙蛋白酶在乳腺上皮转化细胞对雌激素刺激反应中的作用[J].基础医学与临床，2013，33（7）：819-823.

[11] CARRAGHER NO，FONSECA BD，FRAME MC. Calpain activity is generally elevated during transformation but has oncogene-specific biological function[J]. Neoplasia，2004，6（1）：53-73.

[12] XU F，GU J，LU C，et al. Calpain-2 enhances non-small cell lung cancer progression and chemoresistance to paclitaxel via EGFR-pAKT pathway[J]. Int J Biol Sci，2019，15（1）：127-137.

[13] MENG J，ZHOU X，YANG J，et al. Exposure to low dose ZnO nanoparticles induces hyperproliferation and malignant transformation through activating the CXCR2/NF- KappaB/STAT3/ERK and AKT pathways in colonic mucosal cells[J]. Environ Pollut，2020，263（PtB）：114578- 114589.

[14] ASADZADEH Z，MANSOORI B，MOHAMMADI A，   et al. microRNAs in cancer stem cells：biology，pathways，and therapeutic opportunities[J]. J Cell Physiol，2019，234（7）：10002-10017.

[15] MORATH I，HARTMAN TN，ORIAN-ROUSSEAU V. CD44：more than a mere stem cell marker[J]. Int J Biochem Cell Biol，2016，81（Pt A）：166-173.

[16] ZHANG W，SUI Y，NI J，et al. Insights into the Nanog gene：a propeller for stemness in primitive stem cells [J]. Int J Biol Sci，2016，12（11）：1372-1381.

[17] TSAI PH，CHIEN Y，WANG ML，et al. Ash21 interacts with Oct4-stemness circuity to promote super-enhancer- driver pluripotency network[J]. Nucleic Acids Res，2019，47（19）：10115-10133.

[18] KIMURA Y，SAYA H，NAKAO M. Calpain-dependent proteolysis of NF2 protein：involvement in schwannomas and meningiomas[J]. Neuropathology，2000，20（3）：153- 160.

[19] SALIMI R，BANDARU S，DEVARAKONDA S，et al.Blocking the cleavage of filamin A by Calpain inhibitor decreases tumor cell growth[J]. Anticancer Res，2018，38（4）：2079-2085.

[20] 王旭東，丁姗姗，陈腾祥，等.钙激活中性蛋白酶抑制剂对E2诱导的乳腺癌细胞增殖效应的影响及其意义[J].贵州医药，2009，33（4）：302-304.

[21] 郭阳，金爱，杨莉，等.钙蛋白酶2介导雌激素调控乳腺肿瘤细胞GREB1基因表达[J].贵州医科大学学报，2018，43（6）：630-635.

[22] RODRIGUEZ-AGUAYO C，BAYRAKTAR E，IVAN C，et al. PTGER3 induces ovary tumorigenesis and confers resistance to cisplatin therapy through up-regulation Ras- MAPK/Erk-ETS1-ELK1/CFTR1 axis[J]. EBioMedicine，2019. DOI：10.1016/j.ebiom.2018.11.045.

[23] TANG T，ZHU Q，LI X，et al. Protease NexinⅠis a feedback regulator of EGF/PKC/MAPK/EGFR1 signaling in breast cancer cells metastasis and stemness[J]. Cell Death Dis，2019，10（9）：649-665.

[24] 田继华，常思佳，郭海秀，等. ERK抑制剂U0126通过下调cyclin D1与survivin蛋白表达抑制乳腺癌细胞增殖[J].中国药理学通报，2019，35（8）：1061-1066.

[25] YANG YC，CHIOU PC，CHEN PC，et al. Melatonin reduced lung cancer stemness through inhibiting of PLC，ERK，P38，beta-catenin and Twist pathway[J]. Environ Toxicol，2019，34（2）：203-209.

[26] 劳志云，吴东平，王志勇，等. Cathepsin B通过ERK信号通路促进肺癌细胞A549增殖和迁移[J].临床肿瘤学杂志，2019，24（5）：391-395.

[27] CHOI C，THI TT，VAN NGUT，et al. Promotion of tumor progression and cancer stemness by MUC15 in thyroid cancer via the GPCR/ERK and intergrin-FAK signaling pathways[J]. Oncogenesis，2018，7（11）：85-97.

[28] WANG GS，HUANG YG，LI H，et al. ERK/CANP rapid signaling mediates 17 beta-estradiol-induced proliferation of human breast cancer cell line MCF-7 cells[J]. Int J Clin Exp Med，2014，7（1）：156-162.

（收稿日期：2020-03-02 修回日期：2020-05-13）

（编辑：林 静）