鸟-胞内分枝杆菌复合群鸟和胞内分枝杆菌亚种对20种药物的敏感性特征及亚种间药物敏感性比较

肖士林, 赵秀芹,刘志广,刘海灿,李马超,蒋 毅,赵丽丽,李桂莲,万康林

鸟-胞内分枝杆菌复合群(Mycobacteriumavium-intracellularecomplex, MAC)属于非结核分枝杆菌(non-tuberculosis mycobacterium, NTM)中的慢生长分枝杆菌(slowly growing mycobacterium，SGM)。MAC属于不产色菌，无论有无光照，均不产色素，菌落呈灰白色或淡黄色。该复合群菌株广泛存在于土壤和水中，为条件致病菌，可引起肺脏、淋巴结、骨骼、关节、皮肤和软组织等的病变，同时也是引起免疫缺陷综合症患者机会性肺部感染的常见NTM[1-2]。2007年美国胸科及传染染病协会[3]及2012年中华医学会结核病学分会[4]相关的非结核分枝杆菌病诊疗指南均指出：MAC肺病的治疗方案以大环内酯类药物(如克拉霉素和阿齐霉素)为核心，联合乙胺丁醇、利福霉素，且根据病情严重程度联合氨基糖苷类药物。MAC包含鸟分枝杆菌和胞内分枝杆菌2个亚种，目前有报道MAC或2个亚种对不同药物的敏感性[5-7]，但是样本量均较少且对这2个亚种比较药物的敏感性的报道较少。因此本研究拟采用肉汤微量稀释法(微孔板Alamar blue显色法)检测并分析97株鸟分枝杆菌和 172株胞内分枝杆菌对大环内酯类、乙胺丁醇、利福霉素类、氨基糖苷类等方案[3-4]中提到的药物种类以及其它抗分枝杆菌常用的氟喹诺酮类及氯法齐明等共20种药物的敏感性，并分析2个亚种分别对氨基糖苷类、利福霉素类和大环内酯类内各种药物的交叉耐药性及比较2个亚种对不同药物的敏感性差异。

1 材料与方法

1.1菌株 共纳入97株鸟分枝杆菌和172株胞内分枝杆菌临床分离株，所有临床株分离于2005年到 2012年间。97株鸟分枝杆菌中1株来源于安徽，82株来源于福建，11株来源于湖南，2株来源于江西，1株来源于四川。172株胞内分枝杆菌中4株来源于安徽，146株来源于福建，17株来源于湖南，2株来源于内蒙，3株来源于新疆。这些菌株均经对硝基苯甲酸鉴别培养基 (500 μg/mL) 鉴定为NTM, 然后采用多位点PCR方法[8]联合测序检测rpoB,hsp65,ITS,gnd,glpk,secA和sodA等基因并到NCBI数据库上比对鉴定到种[9]。鸟分枝杆菌标准株(95001)和胞内分枝杆菌标准株(95002)由中国医学细菌保藏管理中心(CMCC)提供。

1.2试剂和耗材 CAMHB干粉和牛血清白蛋白-右旋糖苷-过氧化氢酶(Albumin of Bovin-Dextrose-catalase，ADC)营养添加剂购自美国BD公司；Alamar blue试剂购自英国AbD Serotec公司；无菌96孔酶标板购自美国Corning公司；PCR检测试剂购自北京康为生物技术有限公司。选择的抗生素有利福霉素类药物利福平、利福布丁和利福喷丁，氨基糖苷类药物链霉素、卡那霉素、阿米卡星和妥布霉素，氟喹诺酮类药物氧氟沙星、左氧氟沙星、莫西沙星、环丙沙星、司帕沙星和加替沙星，大环内酯类药物克拉霉素、阿奇霉素、红霉素和罗红霉素，多肽类的卷曲霉素，乙胺丁醇及氯法齐明等，上述20种药粉均购自美国Sigma公司。

1.3主要试剂配制 CAMHB液体培养基配制方法为秤取22 g CAMHB干粉2 mL，加入到950 mL蒸馏水中，于121 ℃高压灭菌10 min后置4 ℃冰箱保存。临用时，加入50 mL ADC营养添加剂。Alamar blue显色剂为临用前配制。20种药物均按有效成分进行无菌配制并分装，储存于-20 ℃。

1.420种药物最小抑菌浓度(MIC)测定及敏感性判断方法 2株分枝杆菌标准株及269株分枝杆菌临床分离株对20种药物的MIC检测采用微孔板Alamar blue显色法，具体步骤参照文献[10]。先于96孔板各孔加入100 μL 7H9，然后采用倍比稀释的方法使各药物的浓度梯度为待检浓度梯度的2倍，再向同一行的各孔加入同一菌株的稀释菌液(浓度为50 μg/mL)100 μL，一个微孔板可以做6株菌株对同一种药物的MIC。将上述微孔板置37 ℃培养箱培养5 d。从第6 d开始，在无药对照培养孔中加入70 μL 显色剂(Alarmar blue：5%Tween-80=2∶5)，隔天观察变色情况，若没有变色或变色程度较浅，则继续在另一无药对照孔中加入显色剂，重复操作至观察到变色为止；若颜色从蓝色变成紫红色或粉色，则在含药培养基中加入显色剂。在含药培养基加入显色剂的第2 d，观察结果并记录获得结果的天数。MIC定义为蓝色完全没有发生改变的最小药物浓度。实验设置阴性对照(仅有培养基)、阳性对照(无药但有培养基和细菌)和颜色对照(仅有培养基和带颜色的药物)。所有实验均重复2～3遍，最终结果取均值。对20种药物抗鸟或胞内分枝杆菌的不同临界浓度如敏感，中介及耐药的浓度范围参考文献[11]关于SGM对各药物临界值的规定。

1.5统计分析 采用SPSS 16.0进行统计分析，鸟分枝杆菌与胞内分枝杆菌对不同药物的敏感率比较采用四格表卡方检验，同一亚种菌株对不同药物敏感率的比较采用配对卡方检验，比较时，均将敏感菌株作为一组，中度敏感和耐药菌株作为一组，P<0.05为差异有统计学意义。

2 结 果

2.1鸟分枝杆菌及胞内分枝杆菌标准株对20种药物的敏感性结果 鸟分枝杆菌标准株对利福布丁、4种氨基糖苷类药物(链霉素、妥布霉素、阿米卡星和卡那霉素)、卷曲霉素、左氧氟沙星、莫西沙星、环丙沙星、克拉霉素、阿奇霉素、罗红霉素均敏感，对氧氟沙星中度敏感，对利福平、利福喷丁、乙胺丁醇、司帕沙星和氯法齐明耐药。胞内分枝杆菌标准株对18种上述药物均敏感。2株标准菌株均未检测对红霉素和加替沙星的敏感性。从以上数据可看出，胞内分枝杆菌标准株与鸟分枝杆菌标准株相比敏感药物种类更多。

2.297株鸟分枝杆菌临床分离株对20种药物的敏感性结果 97株鸟分枝杆菌临床分离株经微孔板 Alamar blue显色法检测后结果显示,药物敏感率高于50%的药物从高到低依次是卷曲霉素(100%)，阿米卡星(97.9%)，利福布丁(96.9%)，利福平和卡那霉素(83.5%)，克拉霉素(82.5%)，罗红霉素(76.3%)，链霉素(66.0%)，利福喷丁和妥布霉素(65.0%)，氯法齐明(64.6%)，阿奇霉素和莫西沙星(50.5%)。敏感率低于50%的药物有乙胺丁醇(10.3%)、氧氟沙星(4.1%)、左氧氟沙星(12.4%)、环丙沙星(25.8%)和司帕沙星(39.2%)。见表1。

表1 97株鸟分枝杆菌和172株胞内分枝杆菌分别对20种药物的敏感性结果以及两个亚种对不同药物的敏感性比较Tab.1 Drug susceptibility profiles of 97 Mycobacterium avium and 172 Mycobacterium intracellulare against 20 agents and comparision results between two subspecies

2.3鸟分枝杆菌分别对氨基糖苷类、利福霉素类和大环内酯类药物的交叉耐药性及敏感特征分析 鸟分枝杆菌对氨基糖苷类、利福霉素类和大环内酯类药物的敏感性均较高，对喹诺酮类药物的敏感性较差。经配对卡方检验发现，氨基糖苷类药物中阿米卡星的敏感率明显高于卡那霉素、链霉素和妥布霉素(χ2分别为10.56、29.03和30.03，P值分别为0.001、0.000和0.000)，卡那霉素的敏感率高于链霉素和妥布霉素(χ2分别为13.47和16.06，P值均为0.000)，未发现链霉素和妥布霉素敏感率有统计学差异。共有43株对至少1种氨基糖苷类药物耐药，这些菌株对4种氨基糖苷类药物的交叉耐药性及敏感特征见表2。在34株妥布霉素耐药(或中度敏感)株中，分别有9株、18株和32株对链霉素、卡那霉素和阿米卡星敏感；在33株链霉素耐药株中，分别有18株、31株和9株对卡那霉素、阿米卡星和妥布霉素敏感；在16株卡那霉素耐药株中，分别有1株、15株和0株对链霉素、阿米卡星和妥布霉素敏感；在2株阿米卡星耐药株中，1株对卡那霉素敏感。同时对4种氨基糖苷类药物耐药的菌株只有1株。

鸟分枝杆菌对利福霉素类药物中利福布丁的敏感率明显高于利福平和利福喷丁(χ2分别为9.60和27.27，P值分别为0.001和0.000)，利福平的敏感率亦高于利福喷丁(χ2=8.5，P=0.003)。共有42株对至少1种利福霉素类药物耐药，这些菌株对3种利福霉素类药物的交叉耐药性及敏感特征见表3。在34株利福喷丁耐药株中，分别有26株和32对利福平和利福布丁敏感；在16株利福平耐药株中，分别有14株和8株对利福布丁和利福喷丁敏感；在3株利福布丁耐药株中，对利福平和利福喷丁敏感的各有1株。同时对利福喷丁、利福平和利福布丁耐药的菌株为1株。

鸟分枝杆菌对大环内酯类药物中克拉霉素的敏感率高于罗红霉素和阿奇霉素(χ2分别为4.17和29.03，P值均为0.000)，罗红霉素敏感率高于阿奇霉素(χ2=18.58，P=0.000)。共有48株对至少1种大环内酯类药物耐药，这些菌株对3种大环内酯类药物的交叉耐药性及敏感特征见表4。在48株阿奇霉素中度敏感或耐药株中，分别有31株和28株对克拉霉素和罗红霉素敏感；在23株罗红霉素中度敏感或耐药株中，分别有6株和3株对克拉霉素和阿奇霉素敏感；而17株对克拉霉素中度敏感或耐药的菌株均对罗红霉素和阿奇霉素中度敏感或耐药。

2.4172株胞内分枝杆菌临床分离株对20种药物的敏感性结果 对172株胞内分枝杆菌临床分离株的药敏结果进行分析后发现，药物敏感率高于50%的药物从高到低依次是阿米卡星(99.4%)，卡那霉素(95.9%)，利福布丁(95.4%)，克拉霉素(94.2%)，氯法齐明(87.2%)，卷曲霉素和罗红霉素(86.1%)，利福喷丁(82.6%)，妥布霉素(77.9%)，莫西沙星(75.0%)，乙胺丁醇、妥布霉素和阿奇霉素(65.1%)和链霉素(59.9%)。敏感率低于50%的药物有利福平(34.3%)、氧氟沙星(7.0%)、左氧氟沙星(12.2%)、环丙沙星(28.5%)、司帕沙星(35.5%)、加替沙星(41.3%)和红霉素(27.9%)。结果见表1。

2.5胞内分枝杆菌分别对氨基糖苷类、利福霉素类和大环内酯类药物的交叉耐药性及敏感特征分析 胞内分枝杆菌对氨基糖苷类、利福霉素类和大环内酯类药物的敏感性均较高，对喹诺酮类药物仅对莫西沙星的敏感性就好。经配对卡方检验发现，氨基糖苷类药物中阿米卡星的敏感率明显高于卡那霉素、妥布霉素和链霉素(χ2分别为4.17、35.03和64.13，P值分别为0.031、0.000和0.000)，卡那霉素的敏感率高于妥布霉素和链霉素(χ2分别为25.71和56.38，P值均为0.000)，妥布霉素敏感率高于链霉素敏感率(χ2=15.79，P=0.000)。共有83株(48.26%)胞内分枝杆菌对至少1种氨基糖苷类药物耐药，这些菌株对4种氨基糖苷类药物的交叉耐药性及敏感特征见表2。在69株链霉素耐药株中，分别有44株、64株和69株对妥布霉素、卡那霉素和阿米卡星敏感；在38株妥布霉素耐药株中，分别有13株、33株和38株对链霉素、卡那霉素和阿米卡星敏感；在7株卡那霉素耐药株中，分别有2株、7株和2株对链霉素、阿米卡星和妥布霉素敏感；在1株阿米卡星耐药株中，1株对链霉素敏感。未发现同时对4种氨基糖苷类药物耐药的菌株。

表2 鸟和胞内分枝杆菌对氨基糖苷类药物的交叉耐药性及敏感特征Tab.2 Cross-resistance and susceptibility patterns of the aminoglycosides against Mycobacteriun avium and Mycobacterium intracellulare

胞内分枝杆菌对利福霉素类药物中利福布丁的敏感率明显高于利福喷丁和利福平(χ2分别为18.38和103.01，P值均为0.000)，利福喷丁的敏感率亦高于利福平(χ2=81.01，P=0.000)。共有113株(65.70%)胞内分枝杆菌对至少1种利福霉素类药物耐药且均对利福平耐药，这些菌株对3种利福霉素类药物的交叉耐药性及敏感特征见表3。在113株利福平耐药株中，分别有105株和83对利福布丁和利福喷丁敏感；在30株利福喷丁耐药株中23株对利福布丁敏感；8株利福布丁耐药株中，只有1株对利福喷丁敏感。同时对利福喷丁、利福平和利福布丁耐药的菌株为7株。

表3 鸟和胞内分枝杆菌对利福霉素类药物的交叉耐药性及敏感特征Tab.3 Cross-resistance and susceptibility patterns of the rifamycins against Mycobacteriun avium and Mycobacterium intracellulare

胞内分枝杆菌对大环内酯类药物中克拉霉素的敏感率高于罗红霉素、阿奇霉素和红霉素(χ2分别为8.45、41.40和76.54，P值分别为0.003、0.000和0.000)，罗红霉素敏感率高于阿奇霉素和红霉素(χ2分别为27.84和66.13，P值均0.000)，阿奇霉素敏感率高于红霉素(χ2=25.93，P=0.000)。共有102株(59.30%)胞内分枝杆菌对至少1种大环内酯类药物中度敏感或耐药，这些菌株对3种大环内酯类药物的交叉耐药性及敏感特征见表4。在94株红霉素中度敏感或耐药株中，分别有87株、38株和71株对克拉霉素、阿奇霉素和罗红霉素敏感；在60株阿奇霉素中度敏感或耐药株中，分别有54株、40株和4株对克拉霉素、罗红霉素和红霉素敏感；在24株罗红霉素中度敏感或耐药株中，分别有17株、4株和1株分别对克拉霉素、阿奇霉素和红霉素敏感；10株克拉霉素中度敏感或耐药株中，分别有4株、3株和3株对阿奇霉素、罗红霉素和红霉素敏感。同时对克拉霉素、阿奇霉素、罗红霉素和红霉素中度敏感或耐药的菌株为6株。

表4 鸟和胞内分枝杆菌对大环内酯类药物的交叉耐药性及敏感特征Tab.4 Cross-resistance and susceptibility patterns of the macrolides against Mycobacteriun avium and Mycobacterium intracellulare

2.6鸟分枝杆菌与胞内分枝杆菌对20种药物的敏感性比较 对每种药物进行比较时，将敏感菌株作为一组，中度敏感和耐药菌株作为一组进行卡方检验，结果显示：鸟分枝杆菌临床分离株对利福平和卷曲霉素的敏感率明显高于胞内分枝杆菌，结果具有统计学差异。胞内分枝杆菌临床分离株对利福喷丁、妥布霉素、卡那霉素、乙胺丁醇、莫西沙星、克拉霉素、阿奇霉素、罗红霉素和氯法齐明的敏感率均高于鸟分枝杆菌，结果具有统计学差异。上述2个亚种菌株间敏感率具有统计学差异的11种药物中，9种药物在2个亚种中的敏感率均大于50%，仅有乙胺丁醇在鸟分枝杆菌的敏感率及利福平在胞内分枝杆菌中的敏感率较低(分别为10.3%和34.3%)。具体见表1。

3 讨 论

与结核病的规范治疗与管理相比，我国对非结核分枝杆菌的规范治疗与管理相对较滞后。我国先后于2000年及2012年出台《非结核分枝杆菌病诊断与治疗专家共识》(以下简称共识)[4]，该共识给我国非结核分枝杆菌病的诊断和治疗提供了指导意见。目前我国尚未进行过NTM肺病的流行病学调查，但多个文献均报道MAC检出率最高[5, 7, 12-13]，因此对MAC的药物敏感性进行研究并比较亚种间的药物敏感性差异可帮助临床医生为MAC肺病患者制定有效的治疗方案。

目前国内关于NTM药物敏感性结果的文章多数未具体到种进行报道、或样本量少或采用以罗氏培养基为基质的药物敏感性试验或仅进行常用一二线抗结核药物的敏感性研究[5, 7, 12-13]。如刘东鑫等[5]关于广州市NTM临床分离株药物敏感性的报道中胞内分枝杆菌仅为26株，鸟分枝杆菌为10株，文章未对具体的菌种统计药物敏感率，但总敏感率最高的3种药物为克拉霉素(91.8%)、阿米卡星(93.9%)和阿奇霉素(71.4%)，间接反映出克拉霉素和阿米卡星是治疗MAC的有效药物，这和本研究结果一致。

鸟分枝杆菌和胞内分枝杆菌虽然同属MAC, 但我们的研究结果提示二者之间的药物敏感谱具有较大的差别。本研究结果显示对鸟分枝杆菌抗菌效果较好(敏感率超过80%)的药物包括卷曲霉素、氨基糖苷类中的阿米卡星和卡那霉素、利福霉素类的利福布丁和利福平以及大环内酯类的克拉霉素；对胞内分枝杆菌抗菌效果较好(敏感率超过80%)的药物包括氨基糖苷类中的阿米卡星和卡那霉素、利福霉素类中的利福布丁和利福喷丁、大环内酯类的克拉霉素和罗红霉素、氯法齐明、卷曲霉素等。李燕明等报道克拉霉素、利福布丁和卷曲霉素对鸟和胞内分枝杆菌均有较好的抗菌活性，而阿奇霉素、左氧氟沙星和链霉素抗菌效果较差，这和本研究结果一致[14]。此外，我们还发现2个MAC亚种均对阿米卡星敏感性较高。同时我们也注意到鸟分枝杆菌和胞内分枝杆菌均对共识[4]提到的治疗方案中的药物如乙胺丁醇(敏感率分别为10.3%和65.1%)、大环内酯类中的阿奇霉素(敏感率分别为50.5%和20.4%)、氨基糖苷类中的链霉素(敏感率分别为66.0%和59.9%)和妥布霉素(敏感率分别为65.0%和65.1%)敏感性较差。利福喷丁和利福平均属于利福霉素类药物，本研究却发现利福喷丁对胞内分枝杆菌抗菌效果好而对鸟分枝杆菌抗菌效果较差，而利福平对胞内分枝杆菌抗菌效果较差而对鸟分枝杆菌抗菌效果较好，原因有待进一步研究。虽然如此，笔者通过对两个亚种对氨基糖苷类、利福霉素类和大环内酯类药物的交叉耐药性及敏感特征进行分析后发现，只有0～4%的鸟分枝杆菌或胞内分枝杆菌同时对检测的4种氨基糖类药物耐药或3种利福霉素类药物耐药。这提示我们，对同属类药物进行药物敏感性检测，可以为医生提供选择更多合适药物的机会。同时笔者也发现，虽然只有3.5%的胞内分枝杆菌同时对3种大环内酯类药物耐药(除去红霉素)，但是高达17.5%的鸟分枝杆菌同时对3种大环内酯类药物耐药。大环内酯类药物是治疗MAC感染的关键药物，这提示我们治疗MAC感染时最好先进行菌种鉴定和药物敏感性试验，同时规范治疗和管理，防止大环内酯类药物耐药性的产生。

本研究在2个亚种间进行20个药物的敏感率比较，虽然有些药物如莫西沙星、妥布霉素、乙胺丁醇和阿奇霉素4种药物具有统计学差异，但是在两个亚种间的敏感率均较低(10.3%～75.0%)，在使用时应该慎重；其它具有统计学差异的6种药物如利福平仅在鸟分枝杆菌中敏感率较高(83.5%)；利福喷丁、罗红霉素和氯法齐明仅在胞内分枝杆菌中敏感率较高(分别为82.6%、86.1%和87.2%)；卡那霉素、克拉霉素和卷曲霉素在两个亚种中敏感率均高于80%。李燕明等发现胞内分枝杆菌对莫西沙星敏感率高于鸟分枝杆菌，这和本研究结果一致，但是本研究胞内分枝杆菌对莫西沙星敏感率仅为75.0%，远低于李燕明等报道的98.4%[14]，这可能和菌株来源有关。李燕明等关于利福平在鸟分枝杆菌中的敏感率高于胞内分枝杆菌的结果与本研究一致。共识[4]中提到对MAC进行鸟和胞内分枝杆菌的亚种鉴别对临床治疗无意义，根据我们的实验结果，我们认为是有临床意义的。本研究结果还显示，无论是标准株还是临床株，胞内分枝杆菌均表现出比鸟分枝杆菌敏感药物种类更多且敏感性更高。Koh等[15]报道胞内分枝杆菌感染的预后比鸟分枝杆菌差，笔者推测这可能与胞内分枝杆菌对常用治疗方案中的药物利福平耐药率高于鸟分枝杆菌有关，但也可能与胞内分枝杆菌毒力高于鸟分枝杆菌有关，需要更多证据加以证实。

本研究结果显示除全部鸟分枝杆菌临床分离株对卷曲霉素敏感外，无论是鸟还是胞内分枝杆菌均有部分临床株对多数药物具有耐药性，提示MAC对这些药物可能存在获得性耐药；本研究还发现菌株对同属类药物间具有交叉耐药性，因此，提示我们对MAC疾病的治疗应加以规范，并应加强MAC耐药机制的研究。如有研究发现MAC耐大环内酯类药物与23S核糖体RNA基因(rrl)2 058或2 059位突变高度相关[16]。

本研究对鸟和胞内分枝杆菌的药物敏感性进行了比较，发现二者的敏感谱差异较大，治疗时应谨慎用药。但也应该注意到，本研究结果是根据体外试验得到的结果，容易受培养条件(如培养基、温度、菌液浓度等)、药物敏感耐药临界值的影响，可能与体内试验的结果有差异，因此临床医生在用药过程中应根据疗效加以判断，结合循证医学，准确用药。

(作者对提供菌株的福州市肺科医院、湖南省胸科医院、江西省肺科医院、四川省自贡市疾病预防控制中心、安徽省胸科医院、内蒙古自治区结核病防治研究所和新疆胸科医院的老师们及参加部分工作的郭倩同学深表感谢！)

利益冲突：无