MRI介导的低频聚焦超声联合纳米微泡对提高MSCs治疗脑梗死大鼠的效果研究

罗凌云 廖伟锋

中山大学附属第三医院粤东医院神经内科，广东梅州 514700

卒中俗称脑中风，是危害人类最为严重的脑血管病之一，具有高发病率、高复发率、高致残率和高死亡率的特点，已成为我国居民死亡原因之首[1]。靶向移植间充质干细胞（MSCs）为脑梗死的干细胞移植开拓新的领域，具有易于采集、免疫原性低、扩增能力强、成瘤性低等优点。脐带间充质干细胞（UC-MSCs）已有一些小规模临床试验证明MSCs对脑梗死患者是安全和有效的，且采集方便扩增能力强。由于血脑屏障的存在，外周静脉注射的MSCs向病变脑组织靶向归巢少，会影响治疗效果，而颈动脉注射和立体定向注射MSCs可使更多MSCs迁移至病变脑组织，但存在风险，不利于反复进行[2]。低频聚焦超声联合纳米微泡开放血脑屏障是一个血管细胞系统，它可以防止毒性的物质伤害脑组织。微泡的研究及应用拓展和深化了超声的应用范围，能显著降低超声波产生空化效应所需的能量阈值，减轻组织损伤，增强空化效应，磁共振成像（MRI）增强扫描是迄今最迅速便捷的监测BBB开放的手段[3-4]。我们将探讨MRI引导下用低频聚焦超声联合微泡辐照靶向性开放梗死区的血脑屏障，促进静脉注射的脐带来源的MSCs进入梗死区域，从而增加神经修复效果。

1 材料与方法

1.1 研究方案

1.1.1 MCAO大鼠模型的建立 清洁级SD大鼠80只，重量260～300g，雌雄各半（北京HFK生物技术有限公司）。用2%戊巴比妥钠麻醉（40mg/kg） （山东新华制药股份有限公司，H37020271），背位固定于大鼠手术台，颈部正中切口2～2.5cm，分离双侧甲状腺，钝性分离肌群后暴露右侧颈总动脉、颈内动脉及颈外动脉。结扎颈外动脉、颈总动脉，在颈外动脉距颈总动脉分叉部约1～2mm处剪一小口，经该切口将特制栓线插入颈内动脉，阻塞大脑中动脉起始部。60min后拔出线栓，恢复脑血流灌注。大脑中动脉闭塞和再灌注均通过TCD检查证实。

1.1.2 制备纳米微泡 制备带正电荷的纳米微泡，即称取一定量的HEPC、DSPE-PEG2000、DOTMA（正电荷脂质）完全溶解于氯仿并置于培养皿中，在通风橱内待氯仿自然挥发形成磷脂薄膜，加入水化液，37℃下摇床上水化60min后移至50mL离心管内，全氟丙烷气体置换离心管上方空气后再用超声破碎仪进行声振，声振仪探头置于气液交界处。所得液体通过低速、高速离心获得纳米2级脂质微泡造影剂，在注射前新鲜配置。

1.1.3 MSCs的超顺磁氧化铁（SPIO）标记 转染了EGFP质粒的脐带来源的MSCs由申报单位的生物治疗中心提供。向第4代MSCs培养基内加入SPIO，使铁的终浓度为 50μg/mL，在 37℃、5%CO2孵箱内培养24h。通过普鲁士蓝染色判断SPIO标记是否成功，并用CCK-8法检测细胞活性。

1.1.4 低频聚焦超声联合微泡注射和MSCs注射 实验动物随机分为四组：对照组（MCAO组）；超声微泡组；MSCs组；超声微泡+MSCs组。每组20只，雌雄各半。各组均在MCAO模型建立后的12h进行处理。进行超声微泡辐照时使用3.0T MR定位，用3%戊巴比妥钠肌注麻醉动物，仰卧固定于MRI立体定向治疗系统中，MRI扫描器采用临床标准3.0T信号系统。每次照射前校正系统焦点坐标，根据MRI T2信息调系统焦点至目标区域—右侧内囊后肢、右侧中央前回。实验采用三种MRI扫描序列分别为：照射前T2相扫描（TR：2000msec，TE：75msec，2次采集）获取骨窗信息；实验中T1相扫描（TR：500msec，TE：15msec，2次采集）实时监测脑组织。并行MRA和动脉自旋标记（ASL）成像。注射MSCs时由尾静脉推注纳米微泡1mL和MSCs悬液（细胞总数分别为1×105个），同时用小动物超声探头行超声照射，照射频率分别为0.2、0.5和0.8MHz，照射时间分别为 10、30和 60s。非 MSCs治疗组则注入生理盐水1mL。

1.2 观察指标

1.2.1 治疗前后大鼠的神经功能评分 各组治疗前及处理后2周和4周再次进行神经功能评估。0分，无能缺损症状；1分，不能完全伸展左侧前爪；2分，完全不能完全伸展左侧前爪；3分，轻度向左侧转圈；4分，严重地向左侧转圈；5分，向左侧倾倒。评分为1～4分者视为造模成功。

1.2.2 组织学检测 各组在MRI介导的低频聚焦超声联合纳米微泡对提高MSCs治疗减少脑梗死病大鼠黑质TH阳性和DAT阳性神经元的凋亡情况；提取总蛋白，用酶联免疫吸附法（ELISA）检测营养因子VEGF、NT-3、NGF和BDNF的含量。

1.3 统计学方法

采用SPSS20.0对数据进行处理，计量资料以（x±s）表示，两样本均数比较采用独立样本t检验，多组样本间采用方差分析，计数资料用构成比（%）表示，组间比较采用χ2检验，P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 治疗前后大鼠的神经功能评分比较

四组大鼠治疗后的神经功能评分均有所下降，且超声微泡组、MSCs组、超声微泡+MSCs组治疗2周和4周评分均较对照组更低，超声微泡+MSCs组治疗后神经功能评分最低，差异有统计学意义（P ＜ 0.05），见表 1。

图1 MRI介导的低频聚焦超声联合纳米微泡对提高MSCs治疗减少脑梗死病大鼠黑质TH阳性和DAT阳性神经元的凋亡情况

表2 治疗后大鼠营养因子VEGF、NT-3、NGF和BDNF的含量比较（x ± s，Pg/mL）

2.2 MRI介导的低频聚焦超声联合纳米微泡对提高MSCs治疗减少脑梗死病大鼠黑质TH阳性和DAT阳性神经元的凋亡情况

MRI介导的低频聚焦超声联合纳米微泡对提高MSCs治疗减少脑梗死病大鼠黑质TH阳性和DAT阳性神经元的凋亡，减少了氧化应激对神经元的损伤，见图1（A为TH，B为DAT）。

2.3 治疗后大鼠营养因子VEGF、NT-3、NGF和BDNF的含量比较

四组大鼠治疗后大鼠营养因子与对照组比较，显著升高，超声微泡+MSCs组升高最高，疗效最好，见表2。

3 讨论

脑中风是危害最为严重的脑血管病之一，据统计，我国现存脑卒中患者750万，每年新增卒中患者约250万，约3/4不同程度地丧失了劳动力。目前我们采用静脉溶栓、血管介入治疗等积极措施，并使用抗血小板、调脂药、清除自由基、促进侧枝循环、康复等综合治疗[5-7]。尽管如此，仍有许多脑梗死患者遗留残疾。因此脑梗死患者的神经修复是目前迫切需要攻克的难题[8-10]。已有较多体外实验和动物实验的文献支持MSCs通过神经再生、促进血管再生、神经保护、免疫调节、促进自噬和促进突触形成等机制产生保护梗死组织[11-13]。低频聚焦超声联合纳米微泡开放血脑屏障（BBB），阻止了所有大分子物质和多于98%的小分子物质进入脑，因此BBB在维护脑稳态的同时也成为治疗中难以逾越的屏障[13-15]。微泡能显著降低超声波产生空化效应所需的能量阈值，减轻组织损伤，增强空化效应，它在超声介导下可引起空化作用，在这一过程中产生的能量可引起声孔效应[13-14，16-17]。为确保聚焦超声体外无创治疗的安全性和有效性，影像学的实时监控和疗效评价至关重要。磁共振成像可以增强扫描法检测BBB可逆性开放的准确性和可靠性较高。人脐带间充质干细胞在体外培养可表现出神经元的形态，并表达神经细胞标志物如TU-20、Trk A等，同时可分泌粒细胞集落刺激因子（G-CSF）、血管内皮生长因子（VEGF）等因子。MSCs促进梗死组织恢复的机制推测与神经再生、血管形成、神经保护、免疫调节、促进自噬、促进突触形成和维持代谢平衡等有关，研究者通过颈内动脉注射自体BMSCs的方法使脑梗死患者的临床评分（NIHSS、mRS）较对照组改善显著[5，18-19]。

研究发现，MRI介导的低频聚焦超声联合纳米微泡对提高MSCs治疗脑梗死大鼠可以显著提高大鼠的神经功能，MRI介导的低频聚焦超声联合纳米微泡对提高MSCs治疗减少脑梗死病大鼠黑质TH阳性和DAT阳性神经元的凋亡，减少了氧化应激对神经元的损伤，营养因子VEGF、NT-3、NGF和BDNF的含量也显著增高。

MRI介导的低频聚焦超声联合纳米微泡对提高MSCs治疗脑梗死大鼠可以促进脑梗死的神经修复以改善预后，减轻社会负担和经济负担，具有重要的临床价值和社会意义。