胡黄连苷Ⅱ通过线粒体途径诱导肾癌细胞凋亡的实验研究

张璐 胡莹

150001 哈尔滨，哈尔滨医科大学附属第一医院肾内二科

肾细胞癌占成人肾脏原发性恶性肿瘤的90%，肾细胞癌早期患者通常没有明显的临床症状，当患者确定诊断为肾细胞癌时通常已经发生到晚期[1-2]。因此，寻找一种疗效好、副作用小、安全性高的治疗药物迫在眉睫。胡黄连苷Ⅱ具有降血脂、保护受损的神经细胞、杀菌消毒、抗肿瘤等药理作用[3-4]。以往关于胡黄连苷Ⅱ对肾脏保护作用的研究大都集中在动物体内模型[5-6]，因此，本研究拟在细胞水平进一步研究胡黄连苷Ⅱ对肾癌ACHN细胞凋亡的促进作用。

材料与方法

一、材料

人肾癌ACHN细胞购于中国医学科学院细胞中心，胡黄连苷Ⅱ(纯度为98%)购于上海源叶生物科技有限公司，二甲基亚砜、胎牛血清购于杭州四季青公司，CCK-8细胞增殖检测试剂盒购于江苏凯基生物技术股份有限公司，Hoechst 33258染色试剂盒购于南京建成生物研究所，Annexin-V/PI试剂盒购于北京索莱宝生物公司，BCA蛋白测定试剂盒、PVDF膜及化学发光试剂购于上海碧云天公司，Bax及Bcl-2抗体购于上海碧云天公司。

二、方法

1.细胞培养 在含10 %胎牛血清的DMEM培养基中培养肾癌ACHN细胞，青霉素100 U/mL、链霉素100 μg/mL，培养箱内温度为37 ℃，CO2体积分数为5 %，每3 d传代1次，更换新鲜培养液，取对数期生长的细胞进行实验，细胞密度达到80%左右，用胰酶消化进行实验。

2.肾癌ACHN细胞分组 细胞接种于96孔板中，共分4组，每组5个复孔。其中，对照组以正常培养液培养24 h；胡黄连苷Ⅱ组依胡黄连苷Ⅱ浓度不同分为低、中、高(1 μg/mL、10 μg/mL及100 μg/mL)3个浓试组，培养48 h后进行后续实验。

3.CCK-8法检测肾癌ACHN细胞增殖率 肾癌ACHN细胞接种于96培养板中，100 μL/孔，培养箱中预培养24 h后每孔加入10 L CCK-8溶液，在37 ℃恒温箱中孵育1 h，用酶标仪在450 nm吸光度进行检测。

4.Hoechst 33258染色法检测凋亡 细胞接种于12孔板中，调整细胞密度至5×104/mL，4%多聚甲醛固定细胞10 min，去固定液并用PBS冲洗2次，PBS洗涤时手动晃动数次。加入Hoechst染色液后室温避光反应10 min，PBS洗涤2次后再超净台中避光风干，倒置荧光显微镜下观察并拍照。

5.Annexin V/PI检测凋亡 肾癌ACHN细胞接种于6孔板中，0.1%胰酶(不含EDTA)消化各组细胞后制备细胞悬液。1 000 r/min离心后收集细胞并转移至含有300 μL缓冲液的离心管中，分别加入5 μL Annexin-V和10 μL PI，室温下避光反应30 min后上机检测细胞凋亡率。

6.Western blot法检测肾癌ACHN细胞内Bax及Bcl-2的蛋白表达 提取蛋白质后以Brandford法测定每个蛋白样品的蛋白浓度。每孔加入40 μg蛋白样品，行10%十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳，电压200 V，电泳40 min后转膜，5%的脱脂奶粉溶液4℃封闭2 h，加一抗(稀释浓度1∶1 000)过夜，洗膜后室温下孵育二抗(稀释浓度1∶2 000)1 h，ECL化学发光法自显影并采集图像，计算Bax及Bcl-2的蛋白表达相对表达量。

三、统计学处理

结 果

一、胡黄连苷Ⅱ抑制肾癌ACHN细胞增殖

胡黄连苷Ⅱ 1 μg/mL、10 μg/mL及100 μg/mL3个浓度组处理肾癌ACHN细胞48 h后细胞增殖率分别为74.00%、59.09%及39.67%，3组细胞增殖率与对照组比较均明显降低(P<0.01)。(图1)

注：A.对照组;B.低浓度组;C.中浓度组;D.高浓度组;与对照组比较，aP<0.01图1 CCK-8法检测胡黄连苷Ⅱ不同浓度组对肾癌ACHN细胞增殖率的影响

二、胡黄连苷Ⅱ促进肾癌ACHN细胞凋亡

Hoechst 33258染色剂可以进入凋亡细胞的细胞核，在荧光显微镜下，表现为致密颗粒状强荧光集聚(亮蓝色高荧光)。胡黄连苷Ⅱ 1 μg/mL、10 μg/mL及100 μg/mL 3个组分别处理肾癌ACHN细胞后，Hoechst 33258染色均可见细胞出现亮蓝色荧光颗粒，以100 μg/mL胡黄连苷Ⅱ高浓度组最为明显。(图2)

注：箭头所示为凋亡细胞图2 胡黄连苷Ⅱ对肾癌ACHN细胞凋亡的观察

采用Annexin V/PI检测细胞凋亡情况，对照组细胞凋亡率为(3.2±1.2)%，随着胡黄连苷Ⅱ作用浓度的递增，肾癌ACHN细胞凋亡率呈剂量依赖性递增，1 μg/mL、10 μg/mL及100 μg/mL胡黄连苷Ⅱ组的细胞凋亡率分别为(11.5±3.3)%、(25.2±4.3)%、(36.1±5.0)%，与对照组比较均显著增加(P<0.01)。(图3)

注：A.对照组;B.低浓度组;C.中浓度组;D.高浓度组;与对照组比较，aP<0.01图3 胡黄连苷Ⅱ对肾癌ACHN细胞凋亡率的影响

三、胡黄连苷Ⅱ对Bax及Bcl-2蛋白表达的影响

1 μg/mL、10 μg/mL及100 μg/mL的胡黄连苷Ⅱ作用于肾癌ACHN细胞48 h后，Bax蛋白的表达较对照组升高，差异均有统计学意义(P<0.05)；1 μg/mL、10 μg/mL及100 μg/mL的胡黄连苷Ⅱ作用于肾癌ACHN细胞48 h后，Bcl-2蛋白表达较对照组下降，差异均有统计学意义(P<0.05)。(图4)

注：与对照组比较，aP<0.05，bP<0.01图4 胡黄连苷Ⅱ对肾癌ACHN细胞内Bax及Bcl-2蛋白表达的影响

讨 论

肾癌是泌尿系统中恶性程度较高的肿瘤，手术及化学药物是治疗肾癌的主要方法，化疗药物通过促进癌细胞凋亡、诱导癌细胞分化、抑制癌细胞增殖发挥作用[7]。现已证明细胞凋亡受阻是肿瘤发病机制之一，采用新的药物诱导细胞凋亡来治疗肿瘤疾病已经成为研究热点[8]。

胡黄连苷Ⅱ为草本植物胡黄连的主要活性成分，具有天然、低毒、高效、价格低廉的特征[3-4，9]。本研究中，我们考察了胡黄连苷Ⅱ对肾癌ACHN细胞的细胞毒作用及其作用机制。CCK-8结果显示，胡黄连苷Ⅱ抑制了肾癌ACHN细胞的生长，且有浓度依赖性。判断细胞凋亡最直观方法为细胞形态学观察。Hoechst 33258核染色法结果显示，对照组细胞核显示为全部蓝染，胡黄连苷Ⅱ处理后的肾癌ACHN细胞呈现核浓缩的亮蓝色荧光团块。此外，Annexin V/PI检测结果从另一个角度认证了胡黄连苷Ⅱ对肾癌ACHN细胞凋亡的促进作用。

细胞凋亡具有复杂的分子生物学特征，涉及一系列基因的表达、调控及激活，从而使机体更好的适应生存环境。细胞凋亡过程中清除了异常细胞，保证了生物体内环境的稳定，为促进系统发育发挥作用[10-11]。多种因素(衰老、药物、氧化损伤、射线)能够诱发凋亡反应，当机体正常的凋亡过程受到破坏或凋亡过程紊乱时，会引发多种疾病，例如自身免疫性疾病及肿瘤[12]。胡黄连苷Ⅱ的抗肿瘤活性体已经在多种细胞系中得到验证，且作用机制各不相同：张淼等[13]研究证实，胡黄连苷Ⅱ通过增加肝癌细胞外源性hepcidin(调节机体铁代谢平衡)表达，有效缓解β-地中海贫血。杨红等[14]研究证实，胡黄连苷Ⅱ通过增加乳腺癌MCF-7细胞中Beclin1蛋白的表达，降低p-PI3K、AKT蛋白的表达增强乳腺癌MCF-7细胞自噬。

Bcl-2家族是线粒体凋亡途径中的重要调节因素，其中，Bcl-2属于抗凋亡基因，Bax属于促凋亡基因，通过调节线粒体膜的通透性诱导细胞凋亡[15]。本研究发现，胡黄连苷Ⅱ诱导了肾癌ACHN细胞Bax蛋白表达上调，Bcl-2蛋白表达下调。胡黄连苷Ⅱ对不同肿瘤细胞的作用机制不同，考虑与肿瘤细胞类型以及不同类型细胞内相关基因表达不同有关。

此外，既往有学者证实胡黄连苷Ⅱ对大鼠肾缺血再灌注损伤后肾细胞凋亡反应具有保护作用[16]。胡黄连苷Ⅱ对不同肾脏细胞作用不同，我们分析其原因与以下因素有关：(1)肿瘤细胞与正常细胞存在本质区别(基因、形态特征、生理和生化)；(2)细胞凋亡与细胞内Bcl-2/Bax表达有关，若细胞50%的Bax与Bd-2或Bd-x1形成异源二聚体，则凋亡受抑制；若80%的Bax以同源二聚体的形式存在，则细胞容易发生凋亡；(3)不同类型的细胞，药物作用的靶点也不同，还有一些我们目前无法探知的因素也会影响药物对不同种类细胞的作用。

综上所述，胡黄连苷Ⅱ通过线粒体途径抑制肾癌ACHN细胞增殖，促进细胞凋亡。本研究结果为临床应用胡黄连苷Ⅱ治疗肾癌提供了理论及实验依据，但体内治疗效果以及药物治疗浓度仍待大规模临床实验进一步研究。