红掌黄化突变体叶片叶绿素合成代谢特征分析

罗 兰，朱思宇，许芳颖，周思雨，苗艳华，谈建中

(苏州大学 建筑学院，江苏 苏州 215123)

1 引言

高等植物叶色突变是比较常见的一种表型突变，以黄化和白化较为常见，这通常是由于突变基因影响了叶绿体的发育或者是叶绿素的合成降解过程所导致[1]。红掌(Anthuriumandraeanum)作为市场上重要的盆花、鲜切花及景观装饰植物，研究红掌叶色突变体的呈色机理对于新奇叶色品种的选育有重要的意义，而对于红掌叶色突变体的研究较少。目前已有研究表明红掌不同叶片颜色中所含的叶绿体的结构和数量都有差异，这直接影响了叶绿素合成及色素生物活性[2]，但对其叶绿素代谢变化没有深入的研究。本研究以红掌品种“阿拉巴马”及其叶色黄化突变体为试验材料，研究其叶绿素及中间代谢产物的含量变化，旨在揭示其突变体类型和黄化的生理机制。

2 材料与方法

2.1 供试材料

供试材料为红掌品种“阿拉巴马”(野生型)的幼叶(CK-Y)、成熟叶(CK-M)和老叶(CK-A)以及叶色突变体的幼叶(Mut-Y)、成熟叶(Mut-M)和老叶(Mut-A)。叶片经双蒸水清洗后用滤纸擦干，液氮速冻后放置于超低温冰箱保存备用。

2.2 叶色表型调查

使用英国皇家园艺学会比色卡(RHSCC)对野生型及其叶色突变体叶片的颜色类型进行分析。

2.3 叶片叶绿素含量的测定

不同叶片的叶绿素a(Chl a)和叶绿素b(Chl b)含量的测定参照李合生[3]的方法，称取0.2 g叶片，浸入10 mL体积比为1∶1的丙酮与无水乙醇混合液中，在黑暗条件下浸提48 h，并不时震荡摇晃，直到叶片完全褪色变白。将上述混合液作为空白对照，分别在波长为663、645 nm处测定提取液的吸光度(Optical density，OD)值，上述步骤重复三次，测得的OD值代入下列公式进行计算。

Chl a含量(mg·g-1)=(12.7×A663-2.697×A645)7×V/(1000W)

(1)

Chl b含量(mg·g-1)=(22.77×A645-4.687×A663)7×V/(1000W)

(2)

式(1)、(2)中A663、A645分别为相应波长下的OD值，V为混合液体积，W为供试叶片的质量。

2.4 叶绿素生物合成中间代谢产物的测定

δ-氨基酮戊酸(ALA)的测定参照张帆[4]等人的方法进行测定；胆色素原(PBG)、尿卟啉原III(Urogen III)和粪卟啉原III(Coprogen III)的测定参照Bogorad[5]的方法；原卟啉IX(Proto IX)、镁原卟啉IX(Mg-Proto IX)和原叶绿素酸酯(Pchl)的测定参照杨海芸[6]的方法进行测定。

3 结果与分析

3.1 红掌“阿拉巴马”叶色突变体的表型特征

野生型幼叶(CK-Y)呈正常的绿色泛红，野生型成熟叶(CK-M)呈深绿色，野生型老叶(CK-A)与CK-M相差不大，同样呈深绿色。突变体幼叶(Mut-Y)颜色呈现橘黄色，突变体成熟叶(Mut-M)呈黄绿色，突变体老叶(Mut-A)除边缘衰老变黄外，其他部分略有转绿。从叶色表型来看，该突变体属于叶色黄化突变体(图1)。

2.2 红掌野生型与叶色突变体叶绿素含量的比较分析

采用浸提法分别对红掌野生型及叶色突变体的幼叶、成熟叶、老叶中的叶绿素含量进行了测定，结果如图2所示。在三个发育阶段中，突变体中Chl a和Chl b的含量均显著低于野生型，但随着叶片发育的成熟而逐渐升高。其中，Mut-Y中Chl a和Chl b的含量分别为CK-Y的20.42%和20.93%，总叶绿素含量下降了79.41%；Mut-M中Chl a和Chl b的含量分别为CK-M的26.36%和20.26%，最终总叶绿素含量下降了75.37%；Mut-A中Chl a和，Chl b的含量分别为CK-A的48.59%和58.49%，最终总叶绿素含量下降了48.59%。其次，从Chla/Chlb的比值来看，在突变体的幼叶、成熟叶和老叶中分别为3∶1.49、3∶0.91和3∶1.44，平均值为3∶1.28，野生型幼叶、成熟叶和老叶的Chla/Chlb之比分别为3∶1.45、3∶1.19和3∶1.19，其平均值同样为3∶1.28。

注：括号中数值为英国皇家园艺学会比色卡代码

3.3 红掌野生型与叶色突变体叶绿素合成中间产物的比较分析

为进一步探讨叶色突变体中叶绿素缺失的原因，测定了6种供试材料的叶绿素生物合成中间代谢产物含量，结果如图3所示。首先，在突变体幼叶Mut-Y中，其ALA和PBG含量略高于CK-Y，而Proto IX的含量极显著地降低，仅为CK-Y的14.73%；其下游的Mg-Proto IX和Pchl含量也极显著地低于CK-Y，仅为CK-Y的3.23%和6.56%，最终导致叶绿素含量极显著地降低。其次，在突变体成熟叶Mut-M中，其ALA、PBG及Urogen III含量虽然低于CK-M，但Coprogen III出现了大量积累，其下游产物Proto IX的合成均受到阻遏，相对含量仅为CK-M的36.78%，但与幼叶期相比已有所上升，Chla的相对含量也有所升高，而Chlb的相对含量无显著性变化。此外，与前两个阶段不同的是，在突变体老叶Mut-A中，代谢中间产物的相对含量在Coprogen III处出现了显著下降的现象，约为CK-A的50%，导致Coprogen III及其后续产物的相对含量均有下降。但总体上，相对于前两个阶段均有所升高。

图2 红掌叶色突变体叶绿素含量的比较

4 讨论

高等植物叶绿素生物合成是以L-谷氨酰-tRNA为原料，经过一系列酶促反应，最终形成Chl a和Chl b，其具体过程为Glu→ALA→Urogen III→ Coprogen III→Proto IX→ Mg-Proto IX→Pchl→Chl a→Chl b[7]，其中任意一个步骤受到阻碍均会导致叶绿素合成异常。本研究通过对叶绿素及其生物合成中间代谢产物的相对含量进行测定，发现与野生型相比，突变体幼叶、成熟叶和老叶中总叶绿素含量分别降低了79.41%、79.58%和79.07%，但Chl a/Chl b的平均值未见差异，均为3:1.28，说明该突变体中Chl a和Chl b合成均减少，属于总叶绿素缺失型突变体。

Proto IX是叶绿素生物合成过程中十分关键的中间代谢产物，在金边黄杨和金心黄杨的不同呈色部位中，发现黄色部分的叶绿素含量显著低于绿色部分，其叶绿素合成中间产物Proto IX、Mg-Proto IX以及Pchl的含量均显著低于绿色部分，推测Coprogen III合成Proto IX的过程受阻导致了黄色组织中叶绿素含量的显著减少[8]。同样地，在白肋型烟草以及芥菜型油菜黄化突变体L638-y叶片中，也在Coprogen III合成Proto IX时代谢受阻[9,10]。本研究结果表明，在突变体幼叶与成熟叶中，Proto IX的积累量极显著地下降，仅为野生型的14.73%和36.78 %，推测该突变体的叶片黄化也是在Coprogen III合成Proto IX时受到了严重阻抑。

图3 红掌叶色突变体叶绿素及合成代谢中间产物含量的比较

但不同的是，在突变体老叶中，Coprogen III的积累量显著下降；并且，Coprogen III下游的中间产物及叶绿素含量虽然都低于野生型，但相对于幼叶与成熟叶又表现为升高的变化趋势，表型上也出现叶色返绿的现象，说明其叶绿素合成代谢的受阻部位及程度有所不同。

综上所述，供试突变体的叶绿素含量虽然随着叶片发育而呈持续上升的趋势，但在整个生长期间始终低于野生型，但Chl a/Chl b比值未见差异，属于总叶绿素缺失型黄化突变体。其次，在突变体的幼叶和成熟叶中，叶绿素合成受阻位点在Coprogen III转化为Proto IX处，而老叶在Urogen III合成Coprogen IIII时受到阻抑，但抑制作用相对降低，出现叶色返绿现象，这与前人报导的叶色突变体类型[2]有所不同，可以认为是一种新的红掌叶色突变体，这在红掌叶片呈色机理及品种选育研究方面具有重要的应用价值。