鳜Follistatin基因cDNA的克隆及其胚胎发育表达分析

胡姜丽，徐 蕾，许艺兰，刘晶洁，孙 悦，谢炎东，宾石玉,2*

(1.广西师范大学 生命科学学院，广西 桂林 541006；2.珍稀濒危动植物生态与环境保护教育部重点实验室(广西师范大学)，广西 桂林 541006)

鳜Sinipercachuatsi是我国重要的淡水养殖鱼类，主要以小鱼、虾及昆虫等为食，广泛分布于水库、江河和湖泊，其肉营养丰富，味道鲜美，市场价格高，需求量大[1-3]。近年来我国人工养殖鳜鱼正呈现快速发展的趋势，其胚胎的成活率直接影响到鳜鱼养殖的经济效益[4]。

卵泡抑素(Follistatin，FST)是从哺乳动物卵泡液中分离出的一种单链糖蛋白，是转化生长因子β(transforming growth factor-β，TGF-β)超家族成员之一的一种结合抑制蛋白，对促卵泡素(FSH)具有较强的抑制作用，能与TGF-β超基因家族其他成员相互作用，广泛参与了生物体多种生理功能的调控，包括繁殖、生长发育、神经诱导、渗透压调节、肌细胞生成和免疫调节[5-7]。研究表明，斑马鱼在整个胚胎发育过程都有 FST表达[8]，金鲷Sparusaurata在各组织的表达水平不同，在眼和心组织的FST表达量很低[9]。成体鲶鱼Silurusasotus和牙鲆Paralichthysolivaceus的肝脏与肌肉组织中不表达FST基因[9-11]，大黄鱼Larimichthyscrocea胚胎发育的原肠胚期之前FST基因微量表达，在肌节生成期和孵化后的第30天表达量达到高峰[12]。当前有关鳜FST基因在不同发育时期胚胎发育表达的研究尚未见报道。本文采用RT-PCR技术克隆鳜FST基因cDNA全序列，采用生物信息学方法分析其cDNA序列结构特征，以及氨基酸同源和进化关系，并对FST在鳜不同胚胎时期的表达变化进行分析。本文研究结果可为鳜的生物学提供新的信息，而FST在不同胚胎发育过程中差异表达分析结果可为开展鳜的人工繁殖提供参考。

1 材料与方法

1.1 实验材料及试剂

1.1.1 实验材料

实验用鳜鱼来源于桂林漓江和湖南省水产研究所鳜鱼原种场。人工繁殖和胚胎发育实验操作参考文献[13-14]的方法：在鳜的受精期、卵裂期、囊胚期、原肠胚期、神经胚期、体节出现期、尾芽期、肌肉效应期、心脏搏动期、血液循环期和仔鱼期分别采样，样品用液氮快速冷冻处理后，存放于-80 ℃超低温冰箱备用。

1.1.2 试剂

主要试剂从大连宝生物集团有限公司采购，包括细胞/组织基因组DNA提取试剂盒、DH5α感受态细胞、TaKaRa LA Taq® 和pMD19-T载体试剂盒(TAKARA)、琼脂糖、丙烯酰胺、Taq DNA 聚合酶及mRNA提取试剂盒等。

1.2 实验方法

1.2.1 总RNA提取及cDNA第一链的合成

分别取鳜的受精期、卵裂期、囊胚期、原肠胚期、神经胚期、体节出现期、尾芽期、肌肉效应期、心脏搏动期、血液循环期和仔鱼期样品50～100 mg：首先用mRNA试剂盒提取总RNA，其次通过1%的琼脂糖凝胶电泳(120 V, 15 min)和分光光度计测定其完整性和浓度，然后使用mRNA纯化试剂盒(TAKARA)分离纯化得到富含poly(A)的mRNA，最后以mRNA作为模板，采用Super Script®Ⅱ-RT逆转录酶和poly(T)引物合成单链cDNA。实验步骤和方法按照说明书操作进行。

1.2.2 FST基因的克隆

根据本实验室测得的转录组测序结果获得FST部分基因序列，从GenBank(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/genbank/)中下载其他鱼类的FST基因全序列，用DNAStar 比对进行保守性分析。用Primer 5.0软件在其保守性较高的区域设计FST基因3′端、5′端克隆引物及其通用引物，引物序列详见表1，由上海生工生物工程技术服务有限公司合成。

表1 FST基因克隆引物

以cDNA为模板进行RACE法克隆[15-17]。所扩增的DNA片段经琼脂糖凝胶电泳检测，分析其纯度，具体实验步骤参考徐蕾等[14]的方法。测序结果经模板比对以及网上NCBI数据库(https://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi)中BLAST，确定为目的基因片段后，使用DNAstar软件进行序列拼接得到FST基因全序列。

1.2.3 FST基因的生物信息学分析

对克隆得到的FST序列进行核苷酸序列分析及氨基酸推导应用DNAMAN。FST基因蛋白质的氨基酸组成、等电点及理论分子量计算应用ProtParam在线工具推测。通过PROSITE在线软件进行蛋白质的功能区预测。在NCBI上用OFR Finder程序对获得的cDNA序列进行开放阅读框检测，同时在GenBank数据库中将该序列与已登陆的其他物种的FST进行BLAST初步比较分析，用Clustal W软件进行氨基酸多序列比对，用MEGA 5.0软件构建系统进化树。

1.2.4 引物设计和实时荧光定量PCR

根据克隆出来的ORF 区序列，用Primer 5.0软件进行FST基因的荧光定量引物设计；由上海生工生物工程技术服务有限公司合成引物，选取鳜管家基因β-actin为内参基因(见表2)。采用SYBR GreenⅠ染料法，在荧光定量仪(Bio-Rad公司，CFX 96 touch型号)上进行扩增和数据分析。以最小Ct值和最高荧光值为标准，分别对循环条件、退火温度、引物浓度进行优化。荧光定量PCR的反应体系为25 μL：12.5 μL SYBR®Premix Ex Taq TM，1 μL引物，2 μL cDNA模板，ddH2O补充至总体积。荧光定量反应条件为：95 ℃ 30 s预变性；95 ℃ 5 s变性，58 ℃ 30 s退火，PCR循环40个，最后72 ℃ 15 s延伸。绘制溶解曲线：65～95 ℃，每0.05 ℃读板1次；反应结束后观察实验结果并进行数据处理。

表2 荧光定量引物

1.2.5 数据处理

实时荧光定量PCR后，根据数据处理收集到的目的基因与内参基因的Ct值，目的基因的相对表达量计算运用2-ΔΔCt方法，其中ΔΔCt=((Ct目的基因-Ct管家基因)实验组-(Ct目的基因-Ct管家基因)对照组)。所有结果以平均值±标准差(Mean±SD)表示。

采用SPSS 20.0 软件对所得表达丰度数据进行单因素方差分析(One-Way ANOVA)，采用最小显著差数法(LSD)进行多重比较，并用SigmaPlot 12.0软件对处理完成的数据做鳜FST基因的相对表达折线图。P<0.05表示具有显著性差异。

2 结果与分析

2.1 FST基因cDNA氨基酸序列分析

cDNA氨基酸序列测序结果与NCBI数据库中收录的氨基酸序列进行比对，该序列含有1 271 bp：开放阅读框(ORF)区为960 bp，5′端非编码区(5′UTR)为81 bp，3′端非编码区(3′UTR)为230 bp；编码319个氨基酸残基，蛋白相对分子质量为35.38 kD，等电点为8.45(见图1)。

阴影部分表示kazal-类丝氨酸蛋白酶抑制域，下划线部分表示TGF-β结合结构域，黑框部分表示FST基因核苷酸序列的起始密码子和终止密码子

2.2 氨基酸序列同源性分析和系统进化树构建

将鳜FST基因的氨基酸序列和从NCBI网站找到的其他20个物种FST基因的氨基酸序列进行比对，结果见表3。氨基酸同源性比较发现：鳜FST编码的氨基酸序列与其他物种的氨基酸序列相似性很高，有很高的同源性；与哺乳动物相比，鳜与其他鱼类FST编码的氨基酸序列相似性较高。

表3 鳜FST基因与其他物种编码的蛋白氨基酸同源性比较

用MEGA 5.0软件中的NJ法构建系统进化树见图2。由图2可知，鳜与金鲷首先成簇，再与大黄鱼和牙鲆成簇，表明：鳜与金鲷氨基酸序列相似性为98 %，亲缘关系最近；与大黄鱼氨基酸序列相似性为97 %，亲缘关系较近。鳜FST基因的系统进化树中，鱼类簇较近，哺乳动物簇较近，说明该进化树关系是正确的。

图2 鳜FST基因与其他脊椎动物FST基因成员的进化树

2.3 FST基因的荧光定量表达分析

以鳜的β-actin为内参基因，采用qPCR方法检测FST基因在鳜的不同胚胎发育时期的表达，数据处理后结果表明：在11个不同胚胎发育时期中，鳜FST基因都能检测到表达，详见图3。图3中，在受精期和卵裂期FST低表达；从卵裂期开始，表达开始逐渐明显增加；在神经胚期达到最高表达；之后，表达急速下降；从体节出现期到仔鱼期，表达小幅度波动，均很少；从血液循环期开始，表达有小幅增加。

图中数据为平均值±标准差(n=5)；1～11分别为受精期、卵裂期、囊胚期、原肠胚期、神经胚期、体节出现期、尾芽期、肌肉效应期、心脏搏动期、血液循环期和仔鱼期11个不同的发育时期；图上的不同字母表示差异的显著性(P<0.05)

3 讨论

卵泡抑素(FST)是转化生长因子β(TGF-β)超家族成员中的一种结合抑制蛋白，对促卵泡素(FSH)具有较强的抑制作用，能与TGF-β超基因家族其他成员相互作用，同时，还在胚胎发育、肌肉生长和疾病控制方面具有重要的生物学功能[18]。目前，在人Homosapiens、大黄鱼Larimichthyscrocea、罗非鱼Oreochromismossambicus、斑马鱼Daniorerio、草鱼Ctenopharyngodonidella等已有报道，而鳜鱼卵泡抑素的相关报道还未见。

本文研究采用RACE和常规PCR技术克隆得到鳜FST基因的全长序列为1 271 bp，包括ORF区960 bp、5′端81 bp、3′端230 bp，总共编码319个氨基酸。采用MEGA 5.0建立FST系统进化树模型，将该序列与从NCBI的GenBank数据库中查找的其他物种氨基酸序列进行了比较分析，获得的结果表明：鳜FST编码的氨基酸序列与其他物种的序列相似性很高，具有很高的同源性；FST的氨基酸序列在不同种属间高度保守。构建的系统进化树显示，鳜与金鲷亲缘关系最近，其次是与大黄鱼和牙鲆。进化树中鱼类簇较近，哺乳动物簇较近，这与其分类学的进化分析结果一致。在动物活体内，Follistatin存在多种分子形式，变化范围在31～42 kD。在高等动物中，Follistatin基因前体蛋白包含信号肽、N-端结构域、Follistatin结构域l、Follistatin结构域2、Follistatin结构域3和C-端结构域共6个结构域[19]。在鳜FST蛋白结构域中，半胱氨酸残基高度保守。与其他物种FST蛋白进行比对结果显示，这几个半胱氨酸残基具有非常高的保守性，表明它们在对FST蛋白发挥其生物学功能中有着重要的作用。

近年来人工养殖鳜鱼发展迅速，其胚胎的成活率直接关系到养殖经济效益[4]。彭中友等[20]发现FST可以影响猪胚胎早期的发育能力。本实验选择了11个不同胚胎时期的样本作为研究对象，研究FST基因在鳜不同胚胎发育时期的表达规律，并进行qPCR定量分析，结果表明：在11个不同胚胎发育时期中，鳜FST基因都能检测到表达，与FST在大黄鱼不同胚胎发育时期的表达相符，但具体的相对量有差异。在受精期和卵裂期，FST的表达很低；在神经胚期达到最高表达；之后，表达急速下降；从体节出现期到仔鱼期，表达小幅度波动，均很少；从血液循环期开始，表达小幅增加。在大量研究FST的实验中，更多是研究FST对胚胎早期的神经诱导作用，并发现FST对骨形态发生蛋白(BMPs)具有抑制作用[21]。我们推测FST基因在鳜胚胎发育的原肠胚期和神经胚期可能促进神经的发育。本文研究获得的鳜FST基因序列和生物信息学分析的同源进化特征以及发育时序表达等，将有助于更深一步研究鳜FST的表达机制，并为鳜的人工繁殖和养殖提供理论基础。