基于近红外光谱指纹图谱技术鉴别不同特征知柏地黄丸(浓缩丸)*

郭晓玉，张晓霞，谢彩侠，谢惠英，耿晓桐，雷敬卫

(1.河南中医药大学药学院，郑州 450046；2.郑州铁路职业技术学院药学系，郑州 451460)

知柏地黄丸(浓缩丸)是在六味地黄丸基础上加黄柏和知母两味药而成，可滋阴降火，临床上应用于多种疾病的治疗[1]。由于该制剂生产厂家多，处方中药味较复杂，在知柏地黄丸生产过程中，不同厂家所选用的辅料质量、药材产地及生产工艺参数不尽相同，《中华人民共和国药典》2015年版也并未对相关事项做明确要求，导致不同厂家知柏地黄丸质量有差异。中药是多组分多靶点特殊药品，《中华人民共和国药典》2015年版仅用丹皮酚和马钱苷含量是否合格作为评价知柏地黄丸(浓缩丸)质量的主要指标，并没有体现中药质量特征，也不能反映不同厂家知柏地黄丸(浓缩丸)差异；另外，中药质量稳定性是决定中药质量安全、有效的重要因素之一，它是中药产品在特定的一段时间(有效期)内，保持化学、物理、微生物特性以及疗效的能力[2]，目前关于药品在存放及流通过程中一旦超过其规定有效期，其质量与有效期内中药的差异研究笔者鲜见报道。本课题组前期利用高效液相色谱(HPLC)指纹图谱技术对3个厂家及不同放置时间的知柏地黄丸进行分析发现[3]，3个厂家样品HPLC指纹图谱的相似度较高，质量特征一致性较好，但利用HPLC指纹图谱不能有效区分有效期内与有效期外知柏地黄丸样品，因此亟待寻找一种可以有效鉴别由于辅料、工艺及放置时间等不同所引起差异的知柏地黄丸样品，以规范市场上流通药品的质量特征，防止超出有效期的药品再次流入市场，给药物的安全带来隐患。近红外光谱(near infrared reflectance spectroscopy，NIRS)技术是利用化学计量学方法将物质近红外波段范围的光谱指纹图谱信息与其物理、化学及其他质量特征进行关联，建立的一种快速、无损的绿色分析方法，可以反映物质整体的质量信息[4]。因此，近年来被广泛用于中药这一特殊药品的定性鉴别及定量分析。本研究利用化学计量学方法，对不同厂家知柏地黄丸(浓缩丸)及同一厂家有效期内与有效期外的知柏地黄丸(浓缩丸)的NIRS指纹图谱信息进行分析，试图建立一种可以快速准确鉴别不同厂家、同一厂家有效期内和有效期外知柏地黄丸的方法，以期为建立一套符合中药特点、简便、准确的知柏地黄丸(浓缩丸)质量控制与评价体系提供依据。

1 仪器与试药

1.1仪器 Nicolet 6700型傅立叶变换近红外光谱仪(美国Thermo Fisher Scientific公司)；Milli-Q Academic A 10型超纯水机(美国Millipore公司)；AL 204型分析天平(梅特勒-托利多仪器有限公司，感量：0.1 mg)；CPA225D型十万分之一分析天平(赛多利斯科学仪器有限公司，感量：0.01 mg)；FW-100型高速万能粉碎机(北京中兴伟业仪器有限公司)；101-3AB型电热鼓风干燥箱(北京中兴伟业仪器有限公司)；KQ-500DE型数控超声波清洗器(昆山市超声仪器有限公司)。

1.2试药 知柏地黄丸(浓缩丸)，收集市场上A、B、C3个厂家不同批次知柏地黄丸(浓缩丸)样品82份，其中第1～61份为A厂家生产、第62～72份为B厂家生产，第73～82份为C厂家生产。药品粉碎过60目筛(筛孔内径0.25 mm)后置干燥器中，备用。

2 方法与结果

2.1实验方法 首先，取样品粉末5 g，采用积分球漫反射法，以空气为参比、光谱范围12 000～4000 cm-1、分辨率8 cm-1，温度25 ℃、相对湿度20%～30%、扫描次数为32的扫描条件下，每个样品重复5次，获取82份知柏地黄丸(浓缩丸)样品NIRS指纹图谱；其次，选择用于建立模型的校正集样品和用于验证模型的验证集样品，校正集与验证集比例一般为5：1～ 3：1，以错判个数和性能指数(performance index，PI)作为评价指标，考察不同光谱预处理方法及光谱范围对NIRS指纹图谱质量评价模型判别效果的影响，以确定最佳能够区分不同厂家知柏地黄丸(浓缩丸)差异的光谱预处理方法及光谱范围；最后，采用三重交叉验证法，对所建立的NIR指纹图谱判别分析模型进行准确性和适用性验证。

A厂家知柏地黄丸(浓缩丸)放置一段时间后，有7份样品超出药品规定有效期，超出有效期的时间依次为17，12，11，9，9，7，1个月。为评价有效期内与有效期外知柏地黄丸(浓缩丸)药品差异，笔者采用NIRS评价方法对A厂家已过有效期的7份样品及有效期内的30份代表性样品的指纹图谱进行分析。

2.23个厂家知柏地黄丸(浓缩丸)NIRS指纹图谱的建立与分析

2.2.1校正集及验证样品的选择 82份知柏地黄丸样品NIRS指纹图谱见图1。分别从A厂家61份、B厂家11份和C厂家10份样品中选择51份、9份、8份作为校正集样品，其他作为验证集样品。

2.2.2光谱预处理方法 合适的光谱预处理方法可以降低NIRS中的背景干扰，最大程度保留与样品物理、化学性质相关的有效光谱信息，进而建立可以真实反映样品相关信息的NIRS指纹图谱，提高其分析模型的可靠性。笔者通过分析不同光谱预处理方法所建立的NIRS指纹图谱评价模型的错判个数及PI值优选最佳光谱预处理方法(表1)，由结果知，多元散射校正(multiplicative scatter correction，MSC)+二阶导数(second derivative，SD)+滤波法(norris derivative，ND)为最佳光谱预处理方法。

2.2.3光谱范围的选择 NIRS的光谱范围较宽，不同范围所反映的与样品性质相关的有效信息不同。为选择能代表样品差异的特征光谱信息，以建立可靠的质量评价模型，笔者以不同波段范围所建立的近红外判别分析模型对不同厂家样品的错判个数及PI值来确定最佳光谱范围(表2)，由结果可知最佳建模谱段为7575.57～4157.77 cm-1。

图1 82份知柏地黄丸(浓缩丸)样品近红外光谱指纹图谱叠加图

Fig.1 Overlay chart of the near-infrared reflectance spectra of 82 batches ofZhibaiDihuangPills (concentrated pills)

表1 不同光谱预处理方法对判别分析模型性能的影响

Tab.1 Effects of different pretreatment methods on the performance of discriminant analysis model

光谱预处理方法错判个数PIConstant(原始光谱)093.7MSC(多元散射校正)094.2MSC+SD(二阶导数)192.1MSC+SD+SG(卷积平滑)192.8MSC+SD+ND(滤波法)094.9MSC+FD(一阶导数)093.1MSC+FD+ND194.8SNV(标准归一化)093.7

表2 不同光谱范围对判别分析模型性能的影响

Tab.2 Effects of different spectral ranges on the performance of discriminant analysis model

光谱范围错判个数PI6 039.04～4 008.95093.77 575.57～4 157.77094.99 903.65～4 008.95093.69 903.65～6 569.84092.7

2.2.4NIRS判别分析模型的建立 采用TQ Analyst 8.0版分析软件中的判别分析法，采用MSC+SD+ND方法对光谱进行预处理，在7575.57～4157.77 cm-1波段范围内建立3个厂家知柏地黄丸判别分析模型(图2)，由图2可知，利用所建立的NIRS判别分析模型可以将3个厂家知柏地黄丸(浓缩丸)样品明显分为3类，说明3个厂家样品质量特征存在明显差异。另外，由同一厂家不同批号样品之间的距离可以看出，A、C厂家各自样品之间的距离较接近，样品之间差异较小，说明质量相对稳定，而B厂家不同批号样品虽然聚在一起，但样品之间距离较大，说明B厂家不同批号之间样品质量存在一定差异。

图2 不同厂家知柏地黄丸(浓缩丸)判别分析图(○.A；□.B；△.C)

Fig.2 Discriminant analysis diagram ofZhibaiDihuangPills (concentrated pills) from different manufacturers(○.A；□.B；△.C)

2.2.5模型的验证 为验证模型可靠性，笔者采用三重交叉验证法，随机将样品均分为3组，依次取其中2组作为校正集，另一组作为验证集(表3)，对模型准确性和适用性进行进一步检验(表4)，由表3和表4可知所建判别分析模型性能较好，可以用于快速鉴别3个厂家的知柏地黄丸(浓缩丸)。

表3 不同厂家知柏地黄丸(浓缩丸)三重交叉验证的样品信息

Tab.3 Samples ofZhibaiDihuangPills (concentrated pills) from different manufacturers in triple cross validation

个

2.3A厂家有效期内与有效期外知柏地黄丸(浓缩丸)NIRS指纹图谱鉴别分析结果 按照“3.1”项下采集A厂家30份有效期内和7份有效期外的知柏地黄丸(浓缩丸)样品，通过考察光谱预处理方法和建模波段，最终选择光谱预处理方法为MSC+SG，建模波段为8003.94～4195.20 cm-1。利用TQ Analyst 8.0版分析软件建立A厂家有效期内与有效期外知柏地黄丸(浓缩丸)的近红外判别分析模型(图3)。由图3可知，该模型可以将A厂家有效期内与有效期外知柏地黄丸(浓缩丸)明显分为两类，说明两种样品之间由于物理化学性质差异导致其在8003.94～4195.20 cm-1波段范围内的NIRS指纹图谱不同。因此，利用该波段所反映的NIRS指纹图谱信息可以有效鉴别有效期内与有效期外知柏地黄丸(浓缩丸)样品。另外，由图3可知，有效期外知柏地黄丸(浓缩丸)样品之间距离较大，这可能由于有效期外样品出有效期的时间不同所致。

表4 不同厂家知柏地黄丸(浓缩丸)判别分析模型的三重交叉验证结果

Tab.4 Results of discriminant analysis model ofZhibaiDihuangPills (concentrated pills) from different manufacturers in triple cross validation

数据组合样品数准确率/%组合Ⅰ 校正集(组1,2)55 验证集(组3)27100组合Ⅱ 校正集(组2,3)55 验证集(组1)27100组合Ⅲ 校正集(组1,3)54 验证集(组2)28100

图3 有效期内与有效外知柏地黄丸(浓缩丸)判别分析图(□.有效期外样品；△.有效期内样品)

Fig.3 Discriminant analysis diagram of the expired or unexpiredZhibaiDihuangPills (concentrated pills) in the valid and expired period (□.the expired samples；△.the unexpired samples)

3 讨论

中药是基于中医药理论指导下的多组分相互协同作用从整体上治疗疾病的的一种特殊药品，具有复杂性、整体性等特征。《中华人民共和国药典》2015年版中一般采用某个或某几个化学成分含量的高低作为评价中药质量是否合格的标准，并没有体现中药多组分、多靶点特征，因此并不能真实反映中药临床疗效，导致中医临床常出现中药质量检测合格，但疗效一般的“症对方准药不灵”现象，严重影响了患者对中药的认可度。因此迫切需要构建一套符合中药特点的质量控制与评价体系，以反映中药整体质量特征, 保障其疗效稳定与可控。质量源于设计，针对中药的特殊性，研究者先后将色谱、光谱及生物指纹图谱技术等结合多元统计分析方法应用于中药的质量控制[5-8]，取得了一定的成效。NIRS指纹图谱分析技术主要运用化学计量学软件从样品复杂的NIRS图中提取和样品性质相关的信息，建立光谱特征与样品性质等之间关系的数学模型以分析样品特征，在分析过程中将样品进行简单粉碎后即可扫描其NIRS，所反映的信息主要是中红外光谱区基频吸收的倍频、合频、差频吸收带叠加而成，它反映了样品内部组分、电负性和氢键等化学信息和样品色泽、黏度、密度、颗粒度、均匀度等物理信息，不仅样品处理简单，扫描速度快，而且可以从整体上对样品性状及质量做出初步综合评价[4]。知柏地黄丸(浓缩丸)药味多，质量特征复杂，处方中的药材和辅料来源、制备工艺及药品在市场中的流通时间等因素均影响其质量，《中华人民共和国药典》2015年版以马钱苷和丹皮酚作为控制其质量的指标。前期研究发现，不同厂家及放置不同时间(有效期内及有效期外)的知柏地黄丸(浓缩丸)HPLC指纹图谱相似度较高，而且丹皮酚和马钱苷含量均符合《中华人民共和国药典》2015年版规定，因此无法科学区分及评价不同厂家知柏地黄丸(浓缩丸)药品质量，而且对于流通时间超出有效期的知柏地黄丸(浓缩丸)样品，该方法不能准确鉴别。本研究基于NIRS光谱特点及优势，利用化学计量学知识对3个厂家及超出有效期不同时间的知柏地黄丸(浓缩丸)样品的NIRS光谱指纹图谱信息进行差异性分析。结果表明，利用NIRS指纹图谱技术可以有效鉴别不同厂家及超出有效期之外的知柏地黄丸(浓缩丸)样品，因此NIRS指纹图谱技术可以有效表征知柏地黄丸(浓缩丸)药品质量特征，规范其流通市场。

合理制定药品的有效期是保证药品有效、安全使用的重要前提，目前发达国家销售的植物药都明确标注有效期。中药走出国门，走向国际市场，必须遵循国际行业标准，制定合理的有效期[9]。中药成分复杂，而且在放置过程中可能由于包装材料、外部环境等多方面影响产生复杂物理、化学及生物变化，选择一种方法，可以真实、有效、全面地评价中药在放置过程中所发生的一切变化，通过研究这种变化对中药的安全性和临床疗效的影响来制定中药的有效期，目前关于这方面的研究还很薄弱[10-11]，因此应该结合中药特点，将现代多元分析方法应用到中药有效期研究中，以建立一套科学合理的评价及制定中药有效期的方法。