托法替尼对大鼠实验性自身免疫性脑脊髓炎的抑制作用及其机制*

李玲，李作孝

(西南医科大学附属医院神经内科，泸州 646000)

多发性硬化(multiple sclerosis，MS)是中枢神经系统(central nervous system，CNS)自身免疫性疾病，该病以炎症细胞浸润、白质炎性脱髓鞘、轴突变性、胶质细胞增生为病理特点[1]。其发病机制复杂，至今尚未明确。研究表明，MS发生发展与细胞内多条信号通路异常有关，而Janus激酶-信号转导子和转录激活子(Janus kinase-signal transducer and activator of transcrip-tion，JAK-STAT)信号通路异常对 MS发病有着重要作用[2]。托法替尼(tofacitinib)是一种新型JAK抑制剂，可通过阻断JAK-STAT信号通路进而抑制异常免疫反应。目前托法替尼已被批准为治疗类风湿关节炎的临床用药[3]，除此之外，该药对其他多种免疫性疾病，如炎症性肠病(inflammatory bowel disease，IBD)、银屑病、肾移植排斥反应等均显示明显治疗作用[4-5]，但托法替尼用于治疗MS的报道笔者较少见到。笔者在本实验采用托法替尼干预实验性自身免疫性脑脊髓炎(experimental autoimmune encephalomyelitis，EAE)大鼠模型，观察托法替尼对EAE是否具有脑保护作用，并探讨相关作用机制，以期为托法替尼治疗MS奠定实验基础。

1 材料与方法

1.1实验动物 清洁级健康豚鼠，体质量0.25～0.3 kg；Wistar雌性大鼠，体质量0.2～0.25 kg。均购于西南医科大学实验动物中心，实验动物使用许可证号：SYXK(川)2013-181。饲养温度约24 ℃，饲养相对湿度约50%。

1.2试药 托法替尼(美国辉瑞公司，批号：H20170121)；完全福氏佐剂(complete Freud's adjuvant，CFA，美国Sigma公司，批号：Lot#SLBW5971)；百日咳毒素(pertussis toxin，PTX，上海雅吉生物科技有限公司，批号：20180109)；鼠抗髓鞘碱性蛋白(myelin basic protein，MBP)抗体(1：200，上海安研生物试剂销售公司，批号：20180120)；兔抗胶质纤维酸性蛋白(glial fibrillary acidic protein，GFAP)抗体(1：160，上海安研生物试剂销售公司，批号：20180211)； 链霉菌抗生物素蛋白-过氧化物酶连接法(streptavidin-perosidase，SP)免疫组化试剂盒(武汉博士德生物技术公司，批号：20180204)；多聚甲醛。

1.3方法

1.3.1免疫抗原的制备 苯巴比妥 100 mg·kg-1致豚鼠死亡，无菌条件下迅速分离脊髓，除去脊膜，称重后移入玻璃匀浆器，与等量0 ℃、0.9%氯化钠溶液混合后研磨成50%全脊髓匀浆(whole spinal cord homogenate，WSCH)。CFA与WSCH等体积混合，玻璃注射器抽打至油包水乳状，以滴在水面5 min不散为合格抗原。

1.3.2模型的制备与动物分组 取Wistar雌性大鼠50只，采用完全随机法分为正常对照组、模型对照组及托法替尼小、中、大剂量组，每组10只。模型对照组及托法替尼小、中、大剂量组大鼠双侧后肢足掌皮下注入MBP与CFA，0.2 mL·(100 g)-1，建立模型；正常对照组注入等量无菌0.9%氯化钠溶液与CFA[6]。建模后当天及第2天，将PTX注入各组大鼠腹腔，每只0.2 mL，加强免疫反应。

1.3.3模型的干预 托法替尼小、中、大剂量组自造模前3 d开始连续10 d分别灌胃托法替尼1，2，4 mg·kg-1·d-1，正常对照组和模型对照组灌胃等容量0.9%氯化钠溶液。

1.3.4模型的评价 由同一人自建模后每天上午评判大鼠临床表现及神经功能障碍评分(neurological dysfunction score,NDS)。评分标准：无临床症状为0分；尾部瘫痪拖地，轻度后肢无力为1分；中度单侧后肢或双侧后肢无力为2分；重度双侧后肢无力为3分；四肢全瘫、大小便失禁为4分；抽搐、濒死或死亡为5分[7]。

1.3.5实验终止 在发病高峰期(症状评分连续3 d无加重、四肢全瘫或死亡)处死大鼠，未发病大鼠饲养8周后处死。

1.3.6神经病理组织的制备 无菌条件下，组织剪剖开大鼠头顶部皮肤，暴露枕骨大孔及顶骨，沿枕骨大孔用镊子去除颅盖骨，暴露脑组织，磷酸盐缓冲液(PBS)反复冲洗除去血迹后轻柔取出。将脑组织在4%多聚甲醛液中固定48 h，分别予70%，80%，95%梯度乙醇及无水乙醇脱水，送我院病理教研室做脑组织苏木精-伊红(hematoxylin-eosin staining，HE)染色及脑组织免疫组化染色检查。

1.3.7脑组织病理学观察 脑组织经脱水、透明、浸蜡及石蜡包埋后，取厚度10 μm连续矢状位行石蜡切片，每间隔100 μm取片l张。经烘干、脱蜡后行脑组织HE染色、观察CNS炎症细胞浸润程度。

1.3.8脑组织髓鞘脱失、星型胶质细胞活化情况检测 脑组织石蜡切片经常规脱蜡、水化、修复、0.3%过氧化氢(H2O2)溶液去除过氧化物酶活性、山羊血清封闭组织蛋白后，逐次滴加1：200鼠抗MBP单克隆抗体及1：160兔抗GFAP多克隆抗体恒温孵育60 min，加入二抗孵育及链霉素卵白素孵育，常规二氨基联苯氨(diamine bezidin,DAB)显色、复染、脱水、透明、封片。采用ImagePr-Plus5.1图像分析系统测定MBP免疫组化阳性面积，GFAP免疫组化染色切片随机选取5个高倍视野(×400)，对阳性表达的胞计细数，求其平均值。采用cM0s多功能真彩色病理图象分析系统对免疫组化染色进行定量分析，测定MBP免疫组化阳性表达、GFAP阳性细胞的平均吸光度值积分(IA)。

2 结果

2.1大鼠发病情况 模型对照组与托法替尼各剂量组潜伏期、进展期及NDS均差异有统计学意义(均P<0.01)，托法替尼各剂量组间比较，除大、中剂量组NDS差异无统计学意义，其余均差异有统计学意义(P<0.01，P<0.05)，见表1。

表1 4组大鼠发病情况比较

组别潜伏期进展期dNDS/分模型对照组10.20±1.9910.50±1.843.80±1.03托法替尼 小剂量组16.70±1.50①8.00±2.00①2.30±1.34① 中剂量组20.20±2.44①②5.60±1.51①②1.20±1.40①③ 大剂量组22.90±1.79①②④3.00±1.16①②④0.60±0.84①②F78.4837.6214.31P<0.01<0.01<0.01

①与模型对照组比较，P<0.01；②与托法替尼小剂量组比较，P<0.01；③与托法替尼小剂量组比较，P<0.05；④与托法替尼中剂量组比较，P<0.01。

①Compared with model control group，P<0.01；②compared with low-dose tofacitinib group，P<0.01；③compared with low-dose tofacitinib group，P<0.05；④compared with medium-dose tofacitinib group，P<0.01.

2.2大鼠脑组织病理学变化 模型对照组及托法替尼各剂量组病理评分均差异有统计学意义(P<0.01或P<0.05)，见表2，图1。

表2 4组大鼠脑组织HE染色病理评分

组别HE染色病理评分/分模型对照组3.30±0.68托法替尼 小剂量组 2.50±0.85① 中剂量组1.50±0.97②③ 大剂量组0.70±0.68②③④F20.07P<0.01

①与模型对照组比较，P<0.05；②与模型对照组比较，P<0.01；③与托法替尼小剂量组比较，P<0.01；④与托法替尼中剂量组比较，P<0.05。

①Compared with model control group，P<0.05；②compared with model control group，P<0.01；③compared with low-dose tofacitinib group，P<0.01；④compared with medium-dose tofacitinib group，P<0.05.

2.3大鼠脑组织脱髓鞘及星型胶质细胞活化情况 模型对照组与托法替尼各剂量组脑组织MBP阳性表达平均A值、GFAP阳性细胞平均A值均差异有统计学意义 (均P<0.01)，见表3～4。

3 讨论

笔者在本实验选用雌性 Wistar大鼠建立EAE模型，EAE大鼠在免疫后逐渐出现精神萎靡、活动减少、食量和体质量下降，在发病高峰期出现尾部拖地，前后肢瘫痪，抽搐甚至死亡。其脑组织HE染色结果显示大量炎症细胞浸润并在血管周围形成典型的“袖套样”炎症细胞结构。所以从EAE大鼠的临床表现及脑组织的病理学改变，可以确定本实验EAE动物模型诱导成功。

A.正常对照组；B.模型对照组；C.托法替尼小剂量组；D.托法替尼中剂量组；E.托法替尼大剂量组。

A.normal control group；B.model control group；C.low-dose tofacitinib group；D.median-dose tofacitinib group；E.high-dose tofacitinib group.

Fig.1HEstainingonthebrainsinfivegroupsofrats(×400)

表3 5组大鼠脑组织MBP阳性表达平均A值

组别MBP阳性表达平均A值/(×10-2)正常对照组13.33±0.33模型对照组4.34±0.32①托法替尼 小剂量组5.01±0.34①② 中剂量组8.44±0.20①②③ 大剂量组11.60±0.30①②③④F1712.56P<0.01

①与正常对照组比较，P<0.01；②与模型对照组比较，P<0.01；③与托法替尼小剂量组比较，P<0.01；④与托法替尼中剂量组比较，P<0.01。

①Compared with normal control group，P<0.01；②compared with model control group，P<0.01；③compared with low-dose tofacitinib group，P<0.01；④compared with medium-dose tofacitinib group，P<0.01.

表4 4组大鼠脑组织GFAP阳性细胞平均A值

组别GFAP阳性细胞平均A值/(×10-2)模型对照组16.66±0.23托法替尼 小剂量组13.12±0.28① 中剂量组11.24±0.29①② 大剂量组9.18±0.30①②③F1339.83P<0.01

①与模型对照组比较，P<0.01；②与托法替尼小剂量组比较，P<0.01；③与托法替尼中剂量组比较，P<0.01。

①Compared with model control group，P<0.01；②compared with low-dose tofacitinib group，P<0.01；③compared with medium-dose tofacitinib group，P<0.01.

星型胶质细胞在脑内分布非常广泛，并参与BBB的构成[17]。当在脑组织受到自身抗体刺激后，星型胶质细胞成为最先受损的脑细胞，可先于反应性小胶质细胞和巨噬细胞表达免疫炎症细胞递质(如肿瘤坏死因子、干扰素、白细胞介素等)，启动免疫级联反应，释放细胞因子，趋化炎症细胞边集并穿过内皮细胞，诱发中枢神经系统炎症反应[18]。星型胶质细胞的活化是EAE重要的发病机制之一。GFAP是星型胶质细胞分化的重要标记物，其过度表达标志着组织损伤后星型胶质细胞的增生[19]。研究发现，GFAP基因敲除小鼠EAE症状较野生型症状明显加重[20]。本研究显示，模型对照组大鼠脑组织星型胶质细胞活化明显；而托法替尼各剂量组脑组织GFAP阳性细胞平均A值较EAE组显著减少。提示托法替尼可有效抑制脑组织内星型胶质细胞活化。

总之，托法替尼对EAE大鼠具有脑保护作用，并呈剂量依赖关系。减轻脑组织炎性细胞浸润程度、减轻脑白质脱髓病变、抑制脑组织内星型胶质细胞活化可能是其作用机制之一。