高效液相色谱法测定饮料及发酵酒中纽甜含量

田卫政

摘 要：本文建立了准确、快速检测饮料及发酵酒中纽甜含量的高效液相色谱方法。选用有代表性的果汁（浆）类饮料、发酵酒、风味饮料、含乳饮料及植物蛋白饮料共5种基质，用混合提取液提取，定容后过滤上机测试，蛋白含量较高的样品在提取后中加入蛋白沉淀剂净化后定容过滤待上机测试。选用Shimadzu VP-ODS（4.6 mm×150 mm，4.6 μm）色谱柱，218 nm检测波长，进样量20 μL，离子对试剂和乙腈为混合流动相，用优化后的色谱梯度条件进行洗脱。结果显示，纽甜在0.206～103.0 μg·mL-1范围内线性良好。精密度实验相对标准偏差为0.38%。在1.03～103 mg·L-1加标水平下，回收率在98.7%～108.1%，相对标准偏差为1.7%～4.5%。方法定量限为0.3 mg·kg-1。试验结果显示优化后的方法能够准确定量饮料类样品及发酵酒中纽甜含量。

关键词：纽甜;饮料;发酵酒;快速检测

Abstract：In order to detect neotame content in different types of beverages and fermentation wine by HPLC rapidly and accurately， the optimized testing method was built in this paper. Fruit juice， fermentation wine， flavor drink， young drink and vegetable protein drink were chosen as experiment materials. After being extracted by solution and filtrated， the sample solutions were ready for testing by HPLC. Samples with high protein content were added with protein precipitator and the other processing steps were same as the previous item. Shimadzu VP-ODS （4.6 mm×150 mm， 4.6 μm） was selected as chromatographic column， acetonitrile and ion pair solution were selected as moving phase to test sample solutionsaccording to the optimizedelution procedureat 218 nm wave length. And the injection volume was 20μL. Results showed that the linearity of neotame between 0.206 μg·mL-1 and 103.0 μg·mL-1 accorded with the standard code. RSD of accuracy was 0.38%. Recovery rate was between 98.7% and 108.1% within the scope of 1.03～103 mg·L-1 while RSD of recovery rate was between 1.7% and 4.5%. Limit of quantitation was 0.3 mg·kg-1. The evaluation indexes showed the optimized testing method meet the detection requirements.

Key words：Neotame; Beverage; Fermentation wine; Rapid detection

食品添加劑是现代食品工业发展的产物。食品添加剂的发展对拓展食品种类、保持食品品质、延长货架期有重要影响。食品的风味由色、香、味、形（质构）等构成。甜味是各类食品风味的基础，具有协调调整平衡风味、掩蔽异味、增强口感的重要作用[1]。因此甜味剂是食品添加剂中的重要的分支。根据GB 2760-2014《食品安全国家标准食品添加剂使用标准》规定管理的甜味剂，分为天然甜味剂和人工合成的甜味剂[2]。其中天然甜味剂包括蔗糖、葡萄糖、糖醇为主的糖的衍生物和非糖类天然甜味剂。人工合成甜味剂是指采用化学合成及改性等方法得到的各类人工甜味剂。如糖精钠、甜蜜素、阿斯巴甜、纽甜等[3]。

纽甜学名为N-[N-（3，3-二甲基丁基）]-L-α-天门冬氨-L-苯丙氨酸1-甲酯，是一种功能性甜味剂。甜度为蔗糖的8 000倍，甜蜜素的300倍，阿斯巴甜的40倍。能量值几乎为零。甜味纯正和谐，没有苦味及其他后味。纽甜在体内代谢后形成脱酯化的纽甜和微量甲醇，其代谢物在血液中存留时间较短，最后从粪便和尿液排出体外。稳定的性状和安全性使得纽甜在食品加工行业应用越来越广泛，尤其以饮料中应用较为普遍。纽甜的国家标准检测方法是样品提取后经固相萃取等前处理对样品进行净化，过程较为复杂繁琐，不利于批量检测[4]。目前纽甜含量的测定主要是应用高效液相色谱法，通过特征吸收波长下的吸光度计算浓度[5-9]。本研究对样品前处理以及液相梯度洗脱程序进行优化，旨在获取一套应用于饮料类产品及发酵酒产品简单易操作的纽甜检测方法，为纽甜批量化样品的快速检测提供依据。

1 材料与方法

1.1 材料试剂及仪器

1.1.1 材料及主要试剂

A：果汁类、B：发酵酒、C：风味饮料、D：含乳饮料、F：植物蛋白饮料，共5种（均为市售）;纽甜标准品C20H30N2O5，CAS号：165450-17-9、纯度100.0%（上海安谱实验科技股份有限公司）;辛烷磺酸钠（色谱纯）。

1.1.2 仪器

分析天平[梅特勒-托利多国际贸易（上海）有限公司];离心机（赛默飞世尔科技有限公司）;涡旋振荡器（赛默飞世尔科技有限公司）;超声机（上海科导超声仪器有限公司）;配有二级管阵列检测器的高效液相色谱仪（岛津仪器设备有限公司）

1.2 方法

1.2.1 试剂配制

（1）混合提取液。分别吸取0.8 mL、2.5 mL三乙胺，用水定容至1 000 mL，pH约为4.5。

（2）离子对试剂缓冲液。称取2.00 g辛烷磺酸钠，用500 mL超纯水溶解，加入1.0mL磷酸，加水定容至1 000 mL。

（3）亚铁氰化钾（92 g·L-1）。称取10.6 g亚铁氰化钾[K4Fe（CN）6·3H2O]，加入适量水溶解，用水定容至100 mL。

（4）乙酸锌溶液（183 g·L-1）。称取22 g乙酸锌[Zn（CH3COO）2·2H2O]，加入3 mL冰乙酸，用水定容至100 mL。

1.2.2 标准曲线配制

（1）纽甜标准储备液配制。称取纽甜标准品100.30 mg（纯度为100.0%）至10 mL容量瓶中，用混合提取液定容，纽甜含量为10.30 mg·mL-1。

（2）纽甜标准曲线配制。吸取1 mL纽甜标准储备液至10 mL容量瓶中，用混合提取液定容，得纽甜含量为1.030 mg·mL-1的标准中间液。吸取标准中间液2、50、100、500 μL和1 000 μL，用上述混合提取液定容至10 mL，配制成浓度为0.206、5.15、10.30、51.5 μg·mL-1和103.0 μg·mL-1的系列工作溶液。

1.2.3 样品提取及净化

（1）果汁（浆）类饮料及风味饮料。吸取试样10 mL于50 mL具塞塑料离心管中，加入20 mL混合提取液，涡旋振荡10 min，水浴超声30 min，4 000 r·min-1离心8 min后上清液转移至50 mL容量瓶中，用混合提取液定容。混匀后过0.22 μm滤膜，待液相色谱测定。

（2）发酵酒。将样品超声20min除去气泡。吸取试样10 mL于50 mL具塞塑料离心管中，加入20 mL混合提取液，涡旋振荡10 min，水浴超声30 min，4 000 r·min-1离心8 min后上清液转移至50 mL容量瓶中，用混合提取液定容。混匀后过0.22 μm滤膜，待液相色谱测定。

（3）含乳饮料及植物蛋白飲料。吸取试样10 mL于50 mL具塞塑料离心管中，加入20 mL混合提取液，涡旋振荡10 min，水浴超声30 min，加入蛋白沉淀剂亚铁氰化钾溶液（92 g·L-1）2 mL和乙酸锌溶液（183 g·L-1）2 mL，混匀，将样品在4 000 r·min-1离心8 min，取上清液转移至50 mL容量瓶，于固体残渣中加入提取液20 mL，涡旋振荡后超声10 min，于4 000 r·min-1离心8 min，将上清液转移至50 mL容量瓶，并用混合提取液定容至刻度，混匀后过0.22 μm滤膜，待液相色谱测定。

1.2.4 色谱条件选择

色谱柱：Shimadzu VP-ODS柱（4.6 mm×150 mm，4.6 μm）;二极管阵列检测器检测波长218 nm;进样量20 μL;流速1.5 mL·min-1。

流动相：A相为乙腈;B相为离子对缓冲溶液。通过调整两项洗脱条件，获取良好的峰形和基线分离，见表1。

2 结果与分析

2.1 纽甜检测波长

利用二极管阵列检测器（PDA）对纽甜标准品溶液在波长190～300 nm范围内扫描，结果显示，在190～205 nm范围内，随着波长增加，纽甜含量下降迅速，在205～300 nm波长范围内，以218 nm检测波长下，响应最高见图1。由于200 nm以下的光可以被溶剂（如水，有机溶剂等）强烈吸收，测试结果误差很大，不能应用于检测。因此，选定218 nm作为纽甜的检测波长。

2.2 校准曲线

纽甜校准曲线如图2。纽甜标准品的回归方程为Y=4 090.16X+5 076.00，结果表明纽甜在0.206～103.0 μg·mL-1线性关系良好，相关系数r为0.999 95。

为果汁（浆）类、风味饮料、含乳饮料、植物蛋白饮料等饮料类及发酵酒样品准确定量提供依据。

2.3 精密度试验

取浓度为5.15 μg·mL-1的纽甜标准溶液，重复进样6次。通过计算目标峰峰面积RSD评定方法精密度。纽甜标准品色谱图如图3，精密度结果如表2。由图3知，目标化合物纽甜在6.75 min出峰，峰形对称，接近高斯分布。由表2知，该方法峰面积相对偏差RSD为0.38%，该方法精密度符合检测标准要求。标准品平均浓度为5.09 μg·mL-1，拟合度为98.8%，得出该方法有较高准确度。

2.4 方法定量限

根据仪器噪音的10倍确定定量限。对仪器信号值平行测定20次的信号强度，纽甜的定量限为0.3 mg·kg-1。

2.5 样品测定

取上述5类饮料样品，分别编号A：果汁、B：发酵酒、C：风味饮料、D：含乳饮料、E：植物蛋白饮料，每种样品按照本文优化的方法进行提取纯化处理后上机测试，结果如表3。

2.6 回收率试验

准确量取10.0 mL试样于50 mL具塞塑料离心管中，加入浓度为103.0 μg·mL-1的纽甜标准品工作液100 μL作为J-1组加标样品;加入浓度为1.030 mg·mL-1的纽甜标准中间液100 μL作为J-2组加标样品;加入浓度为10.30 mg·mL-1标准储备液100 μL作为即J-3组加标样品，按照优化过的样品处理方法每个加标浓度平行处理6份上机测试。

2.6.1 果汁及风味饮料3水平加标结果

果汁加标色谱图见图4，风味饮料加标色谱图见图5;果汁及风味饮料回收率见表4。由图4看出，果汁基质中的纽甜峰形对称，基线分离度高。由图5看出，风味饮料基质中的纽甜峰形对称，基线分离度高。由表4看出，果汁基质加标回收率在100.2%～103.7%;回收率相对偏差RSD在1.7%～3.3%范围;风味饮料基质加标回收率在98.7%～104.9%，回收率相对偏差RSD在1.9%～2.2%。回收率和相对标准偏差均符合GB/T 27404-2008《实验室质量控制规范食品理化检测》[10]。优化后的方法能够准确定量果汁基质和风味饮料基质中纽甜含量。

2.6.2 发酵酒3水平加标结果

发酵酒3水平加标结果，发酵酒加标样品色谱图见图6，回收率见表5。由图6知，发酵酒基质中的纽甜峰形对称，基线分离度高。由表5知，发酵酒基质加标回收率在99.9%～105.8%;回收率相对偏差RSD=2.8%～3.4%。回收率和相对标准偏差均符合GB/T 27404-2008《实验室质量控制规范食品理化检测》。优化后的方法能够准确定量发酵酒基质中纽甜含量。

2.6.3 含乳饮料及植物蛋白饮料3水平加标结果

含乳饮料加标色谱图见图7，植物蛋白饮料加标色谱图见图8。含乳饮料及植物蛋白饮料回收率见表6。由图7知，含乳饮料基质中的纽甜峰形对称，基线分离度高。由图8知，植物蛋白饮料基质中的纽甜峰形对称，基线分离度高。由表6知，含乳饮料基质加标回收率在100.3%～104.4%;回收率相对偏差RSD=2.6%～3.7%。植物蛋白饮料基质加标回收在98.8%～108.1%;回收率相对偏差在2.5%～4.5%。含乳饮料和植物蛋白饮料回收率和相对标准偏差均符合GB/T 27404-2008《实验室质量控制规范食品理化检测》。优化后的方法能够准确定量含乳饮料基质和植物蛋白饮料基质中纽甜含量。

3 结论

纽甜在饮料基质中稳定性良好，且由于其甜度高、安全性好、不会造成龋齿等优异特性，使其在饮料中的應用越来越广泛[11]。为增强检测结果准确性、提高检测效率及降低检测成本，本实验通过对4种有代表性的饮料类样品和发酵酒类样品进行方法学验证，此方法在0.206～103.0μg·mL-1范围内线性良好。精密度实验相对标准偏差RSD=0.38%。通过对试验样品基质进行3水平6平行的加标回收实验得出，其在1.03 mg·L-1水平加标回收率在101%～104.9%，相对标准偏差在2.1%～3.8%;10.3 mg·L-1水平加标回收率在102.1%～108.1%，相对标准偏差在1.9%～4.5%;103 mg·L-1水平（饮料类限量）加标回收率在98.7%～100.3%，相对标准偏差在1.7%～2.9%。优化后的样品前处理及液相梯度洗脱条件能够实现对饮料类样品和发酵酒类样品的准确定量。

参考文献：

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[10]中华人民共和国国家质量监督检验检疫总局 中国国家标准化管理委员会.GB/T 27404-2008 实验室质量控制规范食品理化检测[S].北京：中国标准出版社，2008.

[11]Neotame-a new artificial sweetener[J].The Medical letter on drugs and therapeutics，2002，44（1137）：73-74.