水溶性木质素对纤维原料酶水解的影响研究进展

金永灿，陈慧，吴文娟，尉慰奇

(南京林业大学，江苏省制浆造纸科学与技术重点实验室，江苏省林业资源高效加工利用协同创新中心，南京 210037)

木质纤维原料的糖平台技术作为一种非粮食性生物炼制过程，是目前生物质资源科学领域的研究热点[1-2]。木质纤维原料含量丰富且可再生，通过酶水解可将木质纤维原料中的碳水化合物降解为纤维二糖或葡萄糖，并且可以进一步转化为生物燃料，如转化成的乙醇燃料可缓解全球变暖及对石油燃料的过度依赖，是一种可持续发展的生产方式[3]。但是，由于其紧密和复杂的细胞壁结构引起的物理和化学屏障，使木质纤维素生物质对微生物和酶促降解具有天然的顽固性。通常，即使使用较高酶载量或较长的反应时间，直接进行酶水解的木质纤维素生物质的葡聚糖转化的理论最大产率也不能大于20%。因此，需要对木质纤维原料进行预处理，破坏木质素的密封性，增加纤维素酶对纤维素的可及性。

自20世纪90年代以来，木质素作为一种多酚聚合物，其对木质纤维素酶糖化的抑制作用已被广泛研究[4]。主要体现在3个方面：一是物理障碍，即木质素在空间上阻碍了纤维素酶和纤维素之间的物理接触[5]；二是纤维素酶和木质素之间的无效(或非生产性)吸附作用[6]；三是溶解的木质素或类木质素结构(木质素衍生的酚类分子)对纤维素酶的抑制作用[7]。多数学者认为前两种作用是主要的[8]，并且这两种作用相互依存[9]。已有大量研究阐述底物木质素与纤维素酶的非生产性结合是降低纤维素酶活性的主要原因，并提出了多种预处理技术以脱除木质纤维原料中的部分木质素，从而增加了木质纤维原料水解过程中纤维素酶对纤维素的可及性，进而有效提高酶水解效率。也有相关研究表明，在酶水解体系中添加一定量的水溶性木质素可提高预处理木质纤维素的酶水解效率[10]。

笔者总结了近年来木质纤维素酶水解的研究进展，归纳了纤维素酶和木质素之间存在的相互作用，并阐述了对水溶性木质素的结构进行定向调控的方法以及水溶性木质素对酶水解的影响机制。

1 木质纤维素酶水解过程

1.1 木质纤维原料的预处理

植物细胞壁是含有纤维素原纤维网格和复杂“基质”聚合物的复合材料，在植物细胞壁中，木质素的含量仅低于纤维素和半纤维素，其复杂的三维立体网状结构阻碍了纤维素酶在纤维素大分子上的吸附，最终影响纤维素水解成糖和其他有机化合物[4]。木质纤维原料的预处理在生物质精炼中起着至关重要的作用，破坏木质纤维原料紧密的天然结构，脱除部分半纤维素，使结构改性的木质素或木质素衍生分子释放到预处理液中，从而使纤维素易于水解以转化为生物燃料[11-12]。目前广泛应用的预处理方法见表1，主要包括物理法、化学法、物理化学法及微生物法等。预处理温度、pH、木质素与纤维素的保留与脱除、预处理产物及这些因素的协同作用，对木质素与纤维素酶的相互作用具有重要影响，甚至会得到相互矛盾的结果。一般而言，碱性或有机溶剂预处理对木质素有不同程度的降解溶出作用，而酸性或蒸汽爆破预处理则主要溶解半纤维素，大部分木质素仍然保留在纤维原料中。无论采用何种方式，总有一定量的木质素残留在纤维原料中，并且木质素的分布和化学结构均发生变化，有可能引起其对纤维素酶的非生产性吸附的变化。通过预处理脱除纤维原料中的部分木质素，可有效提高底物的酶水解效率，但脱木质素率达到一定程度后继续脱除木质素，由于伴随着碳水化合物的降解，反而不利于酶水解总糖转化的提高。

表1 木质纤维原料的预处理方法Table 1 Pretreatment methods for lignocellulosic raw materials

1.2 木质纤维原料的酶水解

木质纤维素生物质进行生物转化至关重要的步骤是通过纤维素酶将预处理后的木质纤维素生物质水解成可发酵的单糖。木质纤维素生物质的水解方法主要有酸法水解和酶法糖化。酶水解与酸水解方法相比，反应条件相对温和，得到了较快的发展，但纤维素酶成本相对较高[26]。另外，底物的特征(结晶度、聚合度、纤维素的可及表面积和木质素的含量)、纤维素酶活性和反应条件都是影响纤维素酶可及性和水解得率的因素。

纤维素酶(cellulase)[27]是一种由多种酶组成的体系复杂的混合酶，主要由内切酶、外切酶、β-葡萄糖苷酶和木聚糖酶组成，通过各组分之间的相互协同作用将纤维素水解成葡萄糖[28-29]。纤维素酶的结构和水解过程见图1[1]。

图1 木质纤维原料预处理及纤维素酶-木质素相互作用[1]Fig. 1 Schematic illustration of cellulose-lignin interactions dependent on lignin alteration during lignocellulosic pretreatment

2 木质素与纤维素酶之间的相互作用

已有大量研究阐述底物木质素与纤维素酶的相互作用，一般认为两者间发生非生产性吸附或无效吸附[30-31]。通常认为木质素是酶水解的主要障碍之一。迄今为止主要提出了3种纤维素酶和木质素之间的非共价相互作用(图1)，即疏水作用、静电作用和氢键作用，这些相互作用随预处理后木质素物理化学性质的变化而变化[32]。

2.1 疏水作用

疏水作用是纤维素酶与溶解木质素或残余木质素非生产性结合的主要特征。Palonen等[6]的研究认为，木质素和纤维素酶之间的非生产性吸附与疏水性作用有关。Qin等[33]将里氏木霉(Trichodermareesei)ATCC 26921(一种商业纤维素酶系统)固定在硅片上，用原子力显微镜测量纤维素酶与木质素非生产性结合中所涉及的力。使用硫酸盐木质素或羟丙基纤维素涂覆的原子力显微镜探针与固定在硅片的纤维素酶作用，比较纤维素酶和木质素以及纤维素之间的作用力。试验结果表明：纤维素酶与硫酸盐木质素之间的黏附力比和羟丙基纤维素之间的力高45%；纤维素酶和疏水性探针之间的分子相互作用分别比具有—COOH和—OH基团的探针的分子相互作用高13%和43%。Börjesson等[34]则指出，与外切纤维素酶TrCel7A相比，内切纤维素酶TrCel7B由于具有较强的疏水性更易与分离木质素结合，但两种酶的催化域与木质素的结合程度相似。木质素比纤维素具有更强的疏水性，因此根据疏水作用理论，纤维素酶更易与木质素发生结合。Lu等[35]研究表明，纤维素酶与木质素由于疏水作用的结合导致酶活的降低与纤维素酶的组分也有关，木质素导致纤维素酶活性的降低主要体现在其与纤维二糖水解酶的结合，其次是与木聚糖酶，最后是与内切β-1,4葡聚糖酶和β-葡萄糖苷酶的结合。

2.2 静电作用

2.3 氢键作用

氢键作用更有利于解释溶解的酚类化合物中纤维素酶的变性，几乎所有的热化学预处理都可以将酚类化合物从提取物(例如单宁酸)和木质素(例如对香豆酸)中释放到废液中[45-47]。Michelin等[45]研究了热水预处理蔗渣浆液的酶水解过程，结果表明：溶解的酚类物质不但会使纤维素酶和内切木聚糖酶失活，并且还会抑制β-葡萄糖苷酶和β-木糖苷酶的活性。木质素衍生的酚类化合物(例如羟基肉桂酸、4-羟基苯甲酸、阿魏酸、香草酸、对香豆酸)对酶水解的抑制作用也已经得到验证，并显示出对单组分纤维素酶的敏感性不同[5,47-48]。Tian等[46]报道了在特定浓度范围内阿魏酸，对香豆酸和水杨酸对纤维素酶的活化作用，通过紫外光谱分析可知，加入3种酚酸后，纤维素酶的吸光度峰值显著增加，呈现4～5 nm红移，表明酚酸与酶有强烈的相互作用。Zhao等[49]通过研究蒸汽爆破玉米秸秆中酚酸和酚醛对纤维素酶活性的影响，表明酚类化合物对纤维素酶活性的影响至关重要，酚醛是强抑制剂，酚酸在特定浓度范围内也有轻微影响，例如2～4 g/L。蛋白质与酚类化合物之间的相互作用通常归因于氨基酸残基和酚羟基之间的可逆非共价键和不可逆共价键。Tian等[46]进行荧光分析后，结果表明水杨酸与纤维素酶为非共价相互作用，而对香豆酸和阿魏酸与纤维素酶为共价反应。并且通过进一步分析表明，酚酸可破坏酶的α-螺旋结构并增加β-折叠和无规则卷曲的含量，从而降低了酶水解效率。

另外，关于纤维素酶和木质素或木质纤维素底物之间的氢键作用也被广泛研究。Yang等[50]利用从杨木和松树中分离的有机溶剂木质素，研究了木质素对纤维素酶在水解过程中的抑制作用，结果表明：酚羟基是影响木质素抑制作用的关键因素，通过化学反应(如羟丙基化)阻断游离酚羟基可显著降低木质素的抑制作用。Qin等[33]通过利用原子力显微镜测量纤维素酶与木质素非生产性结合中所涉及的力，证实氢键能促进纤维素酶与木质素的结合，但并不占主导地位。

3 水溶性木质素对木质纤维素生物质酶水解的影响

酶水解体系中的木质素对底物的酶水解具有非常重要的影响。底物中的木质素对纤维素酶产生不可逆地吸附，会降低水解体系中的有效酶活，降低酶水解效率；然而水溶性木质素在特定条件下不仅不会对底物的酶水解产生阻碍作用，甚至还会有显著的促进作用。国内外关于水解体系中水溶性木质素与纤维素酶的相互作用及其对酶水解影响的研究较少，并且存在相互矛盾的观点。多数研究认为存在于水解体系中的水溶性木质素会阻碍纤维素酶对纤维素的水解，但同时也有报道指出一定量木质素磺酸盐的存在有利于经酸或碱预处理的木质纤维素生物质的酶水解[51-52]。如果水解液中存在一定量的水溶性木质素，同样也会吸附纤维素酶形成某种“复合物”。有学者认为这种复合物的存在不利于纤维素的酶水解，如Sewalt等[53]发现将纤维素酶与只含有木质素的底物进行预水解，纤维素酶的酶活和蛋白浓度均降低，推测木质素抑制酶水解的机理主要是形成了“木质素-蛋白质复合物”使纤维素酶失活。但Wang等[51]认为水溶性的木质素磺酸盐在水解体系中与纤维素酶形成“木质素-纤维素酶复合物”，会使底物中木质素与纤维素酶之间的非生产性吸附明显减少。

3.1 水溶性硫酸盐木质素

有研究发现，尽管酶水解体系中的底物木质素容易吸附纤维素酶并降低木质纤维素生物质的酶水解效率，但是水溶性木质素在一定条件下会提高酶水解效率[54]。如将适量磺化硫酸盐木质素添加在酶水解体系中，在其他条件相同的情况下(酶用量)，经绿液预处理的马尾松酶水解总糖转化率大幅度提高(从42%提升至75%)[55]。但是，添加水溶性木质素后，不含木质素的底物如漂白纸浆或微晶纤维素的酶水解效率则略有下降。这一现象表明，水溶性木质素促进底物纤维素酶水解很可能与溶解木质素与底物木质素对纤维素酶的“竞争性”吸附有关。Nakagama等[40]认为添加木质素对酶水解产生抑制作用，其主要原因是添加的分离木质素不溶于缓冲液，即所起的作用与底物木质素相似；而Lou等[55]则指出添加硫酸盐木质素并未对酶水解产生明显的抑制作用，还原糖转化率反而略有提高，这主要是因为硫酸盐木质素是由酸沉得到的，含有少量可溶的低分子量木质素，较不溶部分及底物木质素更易与纤维素酶结合，从而抵消了添加木质素的不利影响。

Jiang等[56]利用来自预处理废液中的碱性木质素的可溶性级分(WAL)，研究了水溶性木质素对碱预处理小麦秸秆酶水解糖化的影响。结果表明：加入一定量WAL后，预处理小麦秸秆的酶水解效率显著提高，基于所得结果，提出了一种通过添加水溶性木质素来改善木质纤维素生物质的酶水解糖化新方法。因此，纤维素酶和水溶性木质素之间的相互作用可能是底物中残余木质素与纤维素酶之间非生产性吸附减少的潜在原因，并且水溶性木质素对酶水解的影响取决于底物木质素的存在。郭天雨等[54]将从制浆废液中分离的硫酸盐木质素(KL)进行分级，得到可溶于水的小分子硫酸盐木质素KL5(pH<5的级分)，在预处理杨木的酶水解体系中添加适量的KL和KL5，发现KL的添加对酶水解总糖转化率有抑制作用，而KL5可明显提高总糖转化率。但是，在不含木质素的底物酶水解过程中添加水溶性木质素，对总糖转化率没有促进作用。这一现象说明，水溶性木质素对底物纤维素酶水解的促进作用很可能与水溶性木质素和底物木质素与纤维素酶之间存在的“竞争性”吸附有关，深入解释了木质素分子结构(如官能团、结构单元、连接键型等)与纤维素酶之间存在的相互作用关系，希望从根本上减少底物中的木质素对纤维素酶的无效吸附，最终提高酶水解效率[57]。

3.2 磺化木质素与木质素磺酸盐

对木质素进行改性获得具有特定性能或官能团的高聚物，促进酶水解，实现木质纤维素的全组分综合利用是生物质精炼的重要部分。磺化木质素是亚硫酸盐法制浆黑液以及碱木质素磺化的产物，为线性高分子聚合物。木质素的磺化可以增加其表面活性并减少木质素与纤维素酶之间的疏水作用，降低木质纤维素底物中木质素对纤维素酶的无效吸附；线型的阴离子芳香高聚物会降低纤维素酶的活性，抑制酶水解效率的提高，但其与聚乙二醇的共聚物(AL-PEG1000)对木质纤维素酶水解效率的提高远远大于聚乙二醇本身[58]。有研究指出，将一定量的表面活性剂加入到酶水解体系中，会提高纤维素酶水解的效率。近年来，一些学者发现，木质素磺酸盐作为阴离子表面活性剂可有效提高木质纤维原料的酶水解效率[51,59-60]。Wang等[58]通过来自亚硫酸钠预处理黑液中的木质素磺酸盐来改善木质纤维素的酶水解，结果发现木质素磺酸盐的添加能提高酶水解效率，这与木质素和纤维素酶发生非生产性结合而抑制酶水解的传统观点相矛盾。Wang等[60]研究了磺化的硫酸盐木质素(SL)对经过不同预处理后的杨木酶水解效率存在的影响，结果发现在酶水解体系中添加适量SL后，经绿液和酸性亚硫酸氢盐预处理后杨木的酶水解效率明显提高，但对经亚硫酸盐-甲醛预处理后杨木的影响不大。这一研究的重要贡献在于明确了磺化木质素对酶水解的促进作用与底物木质素有关，见图2。从图2a可知，芒草、杨木和马尾松3种原料经绿液预处理后的木质素质量分数分别为13.2%,22.3%和31.5%，达到最高酶水解转化率的SL添加量分别为0.1,0.2和0.3 g(以每克底物为基准)；在不含木质素的漂白化学浆及微晶纤维素的酶水解中添加SL，其酶水解转化率几乎恒定不变(图2b)。研究还表明，在水解体系中添加SL能大幅度缩短经绿液预处理马尾松的酶水解时间(图2c)或降低酶用量(图2d)。

图2 酶水解过程磺化木质素的添加对酶解效率的影响[60]Fig. 2 Effect of the addition of sulfonated lignin on enzymatic hydrolysis efficiency

木质纤维素全溶体系以及石英晶体微天平在纤维素酶吸附与解吸研究的应用，为研究木质素与纤维素酶的相互作用提供了便利[61]。Lou等[55]在水解底物中添加适量的可溶性木质素磺酸钠(SXP)，发现SXP会与木质素发生竞争吸附，通过石英晶体微天平(QCM-D)分析可知，SXP不仅能提高纤维素酶对纤维素的活性,而且还能降低纤维素酶在木质素上的非生产性吸附。朱杨苏等[57]利用QCM-D研究了磺化木质素对纤维素酶与木质纤维素生物质之间吸附作用的影响，表明磺化木质素能够促进底物的酶水解效率。

3.3 水溶性木质素对纤维素酶水解的促进机理

在酶水解体系中加入可溶性的木质素后，纤维素酶会和底物中的内源性木质素及加入到体系中的外源性木质素同时作用，而木质素与纤维素酶的相互作用受其分子结构的影响。水溶性木质素和纤维素酶之间发生的相互作用可有效减少酶在底物木质素上的无效吸附，进而提高酶水解效率。因此，水溶性木质素在一定条件下可以提高纤维素酶水解的效率,这与水溶性木质素和纤维素酶之间相互作用而形成的“木质素-纤维素酶复合物”有关。与纤维素酶蛋白分子相比，水溶性木质素的分子量相对较小，能在特定条件下与纤维素酶的吸附域结合形成溶于缓冲液的复合物，即水溶性木质素封闭的是纤维素酶的吸附域。吸附域的封闭不利于酶与纤维素结合，因此对纯纤维素底物的酶水解并没有促进作用，但在底物含有木质素的条件下，极有可能是通过减少纤维素酶与底物木质素的非生产性吸附，导致酶水解效率的显著提升，这是水溶性木质素促进纤维素酶水解的关键机制。另外，可以通过木质素分子结构调控适度增加纤维素酶与外源性木质素的相互作用，减少与内源性木质素的相互作用，有利于促进纤维素的酶水解转化，见图3[56]。对木质素进行改性获得具有特定性能或官能团的高聚物，降低底物木质素对纤维素酶的无效吸附是实现木质纤维素的全组分综合利用，促进酶水解，提高木质纤维素生物质精炼中糖转化效率的有效途径。木质素经过磺化可以使其表面活性增加，使木质纤维素生物质中的底物木质素对纤维素酶的无效吸附作用减弱。尽管这些木质素的改性方法可以进一步提高酶水解效率，但是其作用机理尚不完全清楚，且无法实时原位观察木质素与纤维素酶的相互作用，因此研究木质素与纤维素酶的作用机理是改性木质素结构的前提。

图3 通过添加改性的水溶性木质素来改善酶解糖化[56]Fig. 3 A proposed process to improve the enzymatic saccharification by adding modified water-soluble lignin derivatives

4 展 望

传统的理论认为添加助剂的作用是通过封闭底物木质素的疏水区域而降低木质素对酶的吸附，但这一理论不能解释已有研究中添加水溶性木质素后预处理物料的酶水解转化率有显著提高这一现象。根据已有研究进行假设，与酶蛋白分子比较，溶出木质素的分子量相对较小，会在一定条件下与纤维素酶的吸附域结合，形成溶于酶水解缓冲液的复合物，即水溶性木质素封闭的是纤维素酶的吸附域。吸附域的封闭使酶与纤维素无法结合，因此不能提高不含木质素的纯纤维素底物的酶水解效率，但在含有木质素的底物进行酶水解时，极有可能是通过减少纤维素酶与底物木质素的非生产性吸附，导致酶水解效率显著提升。这一假设也可以很好地解释添加不溶性木质素对酶水解产生的不同影响。根据已有研究基础深入认识木质素与纤维素酶的相互作用，解译木质素分子结构对其与酶蛋白相互作用的影响机制，以及这种相互作用对底物酶水解的影响，并在理论研究的基础上筛选出合适的预处理和化学改性方法。对木质纤维原料及预处理过程产生的废液、残渣木质素进行定向分子结构调控，并在水解体系中添加适量经过结构调控的改性木质素来改变底物木质素和纤维素酶之间的相互作用，可为选择高效的木质纤维素生物质预处理技术和高经济效益的酶水解助剂提供重要依据，对减少酶用量、降低预处理基质的糖化成本具有重要的理论意义和广阔的应用前景。