饲喂麦秸对湖羊血液代谢的影响

梁栋，孙若琳，施其成，孟振祥，成艳芬，朱伟云

(南京农业大学消化道微生物实验室，江苏 南京 210095)

我国是一个农业大国，粗饲料产量每年可达数亿吨。但当粗饲料得不到合理的利用(如焚烧、土埋等)时将会对环境造成污染并且造成资源浪费[1]。粗饲料是谷物在收割时产生的农副作物，主要包括麦秸、稻秸、玉米秸秆等。粗饲料中粗纤维含量较高，粗蛋白含量较低，由于半纤维素与木质素的共价键结合使粗饲料的适口性比较差[2]。

血液是遍布全身各大组织和器官周围的一种流体组织，机体大部分的新陈代谢过程都有血液的参与，血液主要由血清和血浆两大部分组成，两者都能够反映机体的代谢情况[3]。生物机体的复杂性大大限制了常规的检测技术对机体内潜在的分子机制的探究，也增加了清晰精确的挖掘深层信息的困难性，而代谢组学技术恰恰解决了这些问题[4-5]。研究粗饲料对反刍动物血液代谢的影响，可以帮助了解粗饲料在动物体内的降解和吸收过程，为提高反刍动物粗饲料利用率提供基础数据。本试验以湖羊为试验动物，研究饲喂麦秸对湖羊血液代谢的影响，以期了解麦秸对湖羊营养物质代谢与吸收的影响。

1 材料与方法

1.1 试验动物和日粮设计

试验选取12只体重40 kg左右的健康公湖羊，单笼饲养，预饲30 d后，随机分为2组，每组6只，一组饲喂麦秸，另一组饲喂苜蓿。正式试验期为3周，每日饲喂2次，早晨8:00和下午5:00饲喂，自由采食和饮水。日粮设计参照《肉羊饲养标准》[6]。精粗比为6∶4，日粮组成和营养成分见表1。试验在南京农业大学动物房实施，试验前进行动物房的全面清理和消毒。

表1 饲料组成和营养水平 kg

注:每千克预混料包含维生素A (60～75)kIU，维生素D (31～15)kIU，维生素 E≥50 mg，硫酸铜 150～500 mg，硫酸锌 100～1 400 mg，硫酸铁 300～800 mg，硫酸锰 200～1 000 mg。

1.2 样品采集和处理

于正式饲养期的第0、7、14及21天的晨饲前，取湖羊颈部血液。血液样品放置于离心管中静置1 h进行凝固分层，3 000 r/min低温离心取上清，再12 000 r/min低温离心10 min，取上清分装到1.5 mL离心管中，每管0.2 mL，-80 ℃冻存，用于血液代谢组检测。

1.3 血液代谢组检测

取50 μL样品放入1.5 mL离心管中，加入200 μL甲醇作为萃取液，10 μL 2-氯-L-苯丙氨酸(0.5 mg/mL dH2O储备液)作为内标，涡旋混合30 s，在-20 ℃下静置10 min，12 000 r/min 4 ℃离心15 min，将180 μL上清液转移到新的1.5 mL 离心管中。从每个样品中取20 μL与标准品合并，在真空浓缩器中完全干燥，加入30 μL甲氧基胺盐酸盐于80℃温育30分钟，向样品等分试样中加入40 mol N,O-双(三甲基硅烷基)三氟乙酰胺(BSTFA试剂)，1%三甲基氯硅烷(TMCS)，在70 ℃下孵育1.5 h。当冷却至室温时，将5μL FAME Standard Mixture(在氯仿中)添加到质控样品中，通过气相色谱系统与Pegasus HT飞行时间质谱仪(GC-TOF-MS)分析。

1.4 数据分析

将获得的原始数据进行峰提取、对齐，导出包含样本信息、保留时间、质荷比、信号强度等信息的收集。将质荷比排序，查找内标物，将保留时间进行排序，计算内标归一化。归一化处理后的数据导入 SIMCA 14.1 软件进行模式识别和多变量统计分析。正交化偏最小二乘法判别分析(OPLS-DA)发现两组间差异代谢产物，选取标准为变量投影重要度(Variable Importance for theProjection, VIP)>1且其积分值t-test检验(P值)<0.05。

2 结果

2.1 湖羊血液代谢产物图谱

湖羊血清GC-TOF-MS总离子流色谱见图1。麦秸组和苜蓿组的血清代谢轮廓出峰性状和出峰数量无特别明显差别，进一步鉴定出743个质谱峰，经数据处理后共有578个有效峰能被保留。通过LECO-Fiehn Rtx5代谢物数据库检索，最终定性为386种代谢产物。386种代谢物中，包括198种氨基酸类，87种糖类，45种脂肪类，33种有机酸，其他均为一些生物碱、维生素、碱基衍生物等。

图1 湖羊血清GC-TOF-MS苜蓿(X)和麦秸组(M)离子流图

2.2 饲喂麦秸第7天对湖羊血液代谢物的影响

试验开始前，两组间血液代谢物无显著差异。试验第7天时，麦秸组和苜蓿组血液代谢谱差异显著(图2)。饲喂麦秸显著影响了7种血液代谢物的含量，其中枞酸、丙氨酸、联苯、丙二酸和尿素含量显著增加，果糖2,6-二磷酸酯降解产物和β-丙氨酸含量显著降低(表2)。枞酸、丙氨酸、联苯、丙二酸和尿素上调的倍数分别为6.091、6.833、4.481和1.791；果糖2,6-二磷酸酯降解产物和β-丙氨酸呈现下降趋势。

注：横坐标表示组间差异程度，纵坐标表示组内差异程度。下同

图2 PLS-DA分析饲喂麦秸第7天对湖羊血液代谢物的影响

2.3 饲喂麦秸第14天对湖羊血液代谢物的影响

试验第14天时，麦秸组和苜蓿组血液代谢产物谱差异显著(图3)，饲喂麦秸显著增加了1-甘油-棕榈酸酯、联苯、葵酸和胱氨酸含量(表3)。其中1-甘油-棕榈酸酯上调了1.821倍，联苯上调了1.791倍，葵酸上调了1.352倍，胱氨酸上调了4.371倍。麦秸组没有显著降低的血液代谢产物。

表2 饲喂麦秸第7天时湖羊血液差异代谢物

代谢物质VIPPFCLog2FC枞酸1.830.0046.0912.608丙氨酸1.900.0026.8332.772β-丙氨酸2.100.0000.202-2.321联苯2.370.0004.4812.164果糖2,6-二磷酸酯降解产物2.180.0000.001-9.965丙二酸1.910.0021.7910.252尿素1.900.0070.303-1.722

注：FC结果是麦秸组/苜蓿组的值

Log2(FC)值小于0则表示麦秸组血液差异代谢物质含量低于苜蓿组

图3 PLS-DA分析饲喂麦秸第14天对湖羊血液代谢物的影响

表3 饲喂麦秸第14天时湖羊血液差异代谢物

代谢产物VIPPFCLog2(FC)1-甘油-棕榈酸酯1.580.0211.8210.864联苯1.910.0011.7910.853葵酸1.490.0411.3520.435胱氨酸1.900.0014.3712.127

注：FC结果是麦秸组/苜蓿组的值

Log2(FC)值小于0则表示麦秸组血液差异代谢物质含量低于苜蓿组

2.3 饲喂麦秸第21天对湖羊血液代谢物的影响

试验第21天时，麦秸组和苜蓿组血液代谢产物谱无显著差异(图4)。发现了386种代谢产物。这些代谢产物大多数为氨基酸类。

图4 PLS-DA分析饲喂麦秸第21天对湖羊血液代谢物的影响

3 讨论

血液系统作为机体内部的运输系统，能将从消化道上皮细胞吸收的小分子营养物质运输到机体的各个组织器官以及细胞中，同时又能将机体内无法利用的代谢废物运送到体外，避免机体堆积代谢废物和毒性物质[7]。血液系统通过分泌和释放信号分子来调控机体内各种不同的生理功能。由于血液可以感知机体内小分子物质含量的微小波动，所以血液代谢的结果对试验有很大的参考价值[8]。本试验中饲喂麦秸和苜蓿的湖羊血液代谢差异物质主要有枞酸、丙氨酸、丙二酸、尿素、果糖2,6-二磷酸酯降解产物、β-丙氨酸、1-甘油-棕榈酸酯、联苯、葵酸和胱氨酸。武雪会[7]的研究发现，荷斯坦奶牛血液中的差异代谢差异物质主要有天冬酰胺、异亮氨酸、3-羟基丁酸、丝氨酸、水杨苷、壬酸、辛二酸等，与本试验结果不同，这可能与动物类别有关。马守庆[8]的研究发现，猪血液中的代谢产物主要有3-羟基丁酸、丙酮酸、丙氨酸、苯丙氨酸和一些脂类及有机酸类，和本试验中检测到的大部分血液代谢差异物质相同。

饲喂麦秸升高了丙氨酸、丙二酸、1-甘油-棕榈酸酯，葵酸和胱氨酸含量，可能是麦秸中纤维素含量较高，导致湖羊胃肠道微生物菌群发生变化，从胃肠道上皮吸收入血的微生物发酵产物也发生了改变，所以相应改变了经血液运输到各个器官组织的代谢产物。丙氨酸对于反刍动物是一种重要的生糖氨基酸，可以作为碳骨架载体来合成葡萄糖。在肌肉和其它降解氨基酸的组织中，氨基基团通过转氨基作用以谷氨酰胺的形式储存起来，随后谷氨酰胺将氨基基团通过丙氨酸氨基转移酶转移给丙酮酸，形成丙氨酸和 α-酮戊二酸，丙氨酸进入血液继而运入肝脏并在丙氨酸氨基转移酶作用下催化与上述反应相反的过程，生成丙酮酸并用于糖异生作用，形成葡萄糖并被循环系统运回各组织器官中。丙氨酸在与谷氨酰胺共同作用时，在生物体内具有明显的免疫和升糖作用，同时丙氨酸是血液中氮的运输工具，在一定程度上增加氮的利用率[9]。本试验中，饲喂麦秸显著增加了丙氨酸的含量，并且上调倍数较高，这提示我们饲喂麦秸可能是改变了动物消化道中的肠道菌群结构，使微生物发酵产生的小分子物质发生改变，并且从另一方面证实了饲喂麦秸增强了湖羊体内的升糖作用。还有研究显示，添加外源性的丙氨酸，可能使肠道内丙氨酸浓度增加，从而扰乱了大肠杆菌、克雷伯菌产气菌和贾第虫细胞内外的丙氨酸浓度差，进而影响了生长代谢，这对预防腹泻有一定的积极作用，且对断奶后仔猪的腹泻也有一定的改善[10]。葵酸可以促进一种糖酵解酶例如α烯醇化酶(ENO1)的产生，而ENO1在卵泡颗粒细胞(FGC)中起纤溶酶原受体的作用，多项研究表明FGC可以支持滤泡发育，因此可以说葵酸有助于动物卵泡细胞的发育[11]。谢明[12]的研究中发现，胱氨酸是蛋氨酸代谢转硫途径中重要的代谢产物，其与半胱氨酸之间的转化过程为可逆的，从而间接参与谷胱甘肽、牛磺酸等含硫活性物质的合成，并且胱氨酸可以与蛋氨酸以互作关系增加肉鸡体重，蛋氨酸不足时，较高的胱氨酸可以促进动物生长。胱氨酸作为一种非必需氨基酸，能促进细胞机能，使肝脏功能旺盛，并能中和毒素增强免疫，饲料中添加一定的胱氨酸有利于动物发育，增强肝肾机能，增加体提高毛皮质量，还可以提高饲料转化率[13-14]。本研究中，饲喂麦秸增强了这些物质的代谢，这些增加的代谢产物大多与升糖、饲料转化有关，所以饲喂麦秸可能增强了湖羊对饲料的利用率以及代谢率。

第7天时，β-丙氨酸发生了很大幅度的下降。β-丙氨酸是自然界中存在的唯一种β型氨基酸，不参与蛋白质的合成，不仅是尿嘧啶和胞嘧啶的分解代谢产物，还是组成泛酸、辅酶 A 等的成分，与组氨酸等结合形成肌肽及其衍生物鹅肌肽(存在于动物肌肉中)[15]。对于畜牧动物而言，β-丙氨酸具有多种生理功能：可以作为神经递质调节机体新陈代谢；作为辅酶A和泛酸等活性物质的中间合成体；提高动物对饲料的利用率；提高生产性能。本研究中，饲喂麦秸抑制了β-丙氨酸代谢，这可能导致了湖羊生产性能降低。β-丙氨酸可以通过血液循环到达各个组织器官，在经过肌肽合成酶催化合成功能性肌肽，从而发挥作用，提高肌肉抗氧化能力[16]。肌肽是一种功能性二肽，可以稳定细胞pH值、抑制脂质过氧化、以及清除自由基的功能，有研究发现，β-丙氨酸可以提高肌肽含量[17]。综上，饲喂麦秸可能降低了湖羊对饲料的转化率。β-丙氨酸可以调节畜禽肌肉生长、改善动物产品品质[18]，而饲喂麦秸可能抑制了湖羊的这种代谢调节。

本研究运用代谢组学的方法探索了饲喂麦秸对湖羊血液代谢物的影响，结果发现饲喂麦秸对湖羊血液代谢物产生了显著影响。饲喂7 d时影响最大，随着时间的变化，影响逐减少，21 d时影响消失。杨艳玲[19]的研究中发现，日粮精粗比能显著改变瘤胃内环境和血清中的代谢物质,在长期饲喂麦秸型粗饲料条件下，奶牛逐渐对高精料产生了耐受性，获得了较为稳定的瘤胃内环境和血液代谢物水平。而本试验中，饲喂麦秸使湖羊血液差异代谢物在0-21 d过程中有个动态变化过程，这可能是由于在饲喂初期，日粮类型对湖羊消化道内环境影响较大，而在长期饲喂下，湖羊机体对麦秸产生了适应性，从而使机体内各项指标维持相对稳定。本研究还发现，饲喂麦秸显著影响的代谢物大多与饲料转化率和糖代谢有关，但其中具体机制还有待进一步探索。本研究为麦秸在反刍动物上的应用提供了理论基础。