氮硫共掺杂碳量子点对胃液pH值的精确检测

2020-07-13黄加玲刘凤娇王婷婷刘翠娥郑凤英王振红李顺兴

高等学校化学学报 2020年7期

黄加玲, 刘凤娇,2, 王婷婷, 刘翠娥, 郑凤英,2, 王振红, 李顺兴,2

(1. 闽南师范大学化学化工与环境学院,2. 现代分离分析科学与技术福建省重点实验室&污染监测与控制福建省高校重点实验室, 漳州 363000)

胃癌是人类最常见恶性肿瘤之一, 是全球癌症致死的第三大原因[1]. 目前尚无高敏感性、高特异性的胃癌筛查和诊断方法, 而胃液能直接反映胃代谢情况, 测试高危人群的胃液pH值是简单、经济、有效的胃癌筛查指标之一[2]. 监测新生儿胃液的pH值可预测胃肠功能[3], 从而防止新生儿窒息[4,5]. 因此, 精确测量胃液中的pH值非常重要.

目前体内胃液pH值检测常采用插管方式, 从胃管抽吸胃液, 用0.01级pH精密试纸测定[6]; 或采用动态监测法, 经鼻留置反流监控导管, 将包含有双晶锑金属电极pH监测导管监测器放置于下食道括约肌位置(LES)上5 cm处[7]. 测试方式易使患者产生不适感, 且监测器依赖进口, 费用高. 荧光法不仅在观察pH值时空变化上有优势, 且具有较高的灵敏度, 大多数情况下对细胞无损、对人体无害.

与传统有机染料及半导体量子点相比, 荧光碳量子点具有光学性质稳定[8]、水溶性[9]、易表面官能化[10,11]、生物相容性好[12]和细胞毒性较低[13]等优势, 近几年广泛用于生物成像[14]、化学传感[15,16]、纳米医学[17,18]、光催化[19]和电催化[20]等领域. 其中N,S-CQDs量子产率较高、毒性低[21,22], 已用来测量细胞内pH值, 但对低pH值(<5.00)准确的荧光测量数据仍比较缺乏. 虽已有适用于胃酸环境的N,S-CQDs, 但其精度仅为0.1[23].

本文以水杨酸和硫脲为原料, 采用一步水热法合成了N,S-CQDs, 并对其实时、原位监测人体胃液pH值进行了分析研究, 结果对胃癌早期诊断和预防新生儿窒息具有重要意义.

1 实验部分

1.1 试剂与仪器

水杨酸(C7H6O3)和2-氨基吡啶(C5H6N2)购于上海阿拉丁生化科技股份有限公司; 牛血清蛋白、胃蛋白酶和黏液素购于国药集团上海化学试剂公司; 葡萄糖(C6H12O6)、尿素[CO(NH2)2]、硫脲(CH4N2S)、Na2HPO4、NaH2PO4、NaOH、HCl、NaCl、MgCl2、CaCl2、KCl、CoCl2、NiCl2、CdCl2、MnCl2、FeCl3、CrCl3、CuCl2、MnCl2、PbCl2、ZnCl2、MgCl2和 HgCl均购于西陇化工股份有限公司; 以上所有试剂均为分析纯; 透析袋(1000 Da)购于美国联合碳化Viskase公司; 实验用水为电阻率≥18.2 MΩ·cm的超纯水, 由美国Millipore-Q 超纯水机制备.

PHS-3E型pH计(上海雷磁仪器有限公司); JEM-2100型场发射透射电子显微镜(TEM, 日本JEOL公司); D8 Advance型X射线衍射仪(XRD, 德国Bruker公司); Thermo Scientific Escalab 250Xi型X射线光电子能谱仪(XPS, 美国Thermo Fisher Scientific公司); Zetasizer Nano ZS90型纳米粒度及电位仪(英国Malvern公司); Nicolet iS5型傅里叶变换红外光谱仪(FTIR, 美国Thermo Fisher Scientific公司); ZF-20D型暗箱式紫外分析仪(上海市宝山顾村电光仪器厂); UV-5800PC型紫外-可见分光光度计(上海元析仪器有限公司); Cary Eclipse型荧光分光光度计(美国Agilent 公司).

1.2 N,S-CQDs的制备

将1 mg硫脲和3 mg水杨酸溶于30 mL超纯水, 超声10 min, 转移至50 mL聚四氟乙烯内衬高压反应釜中. 将反应釜于烘箱中加热至200 ℃, 恒温8 h, 自然冷却至室温. 将溶液在11000 r/min转速下离心20 min, 除去大颗粒杂质, 再经透析袋(1000 Da)透析24 h, 经0.22 μm滤膜过滤, 将溶液冷冻干燥, 获得的固体置于冰箱中于4 ℃下保存, 根据实验需要再将固体重新溶解于超纯水中.

1.3 荧光量子产率计算

鉴于N,S-CQDs荧光激发波长为302 nm, 将2-氨基吡啶溶于0.1 mol/L硫酸溶液中(折射率:η=1.33), 测得产率(在285 nm处量子产率60%), 作为标准参照物. 将碳量子点溶于超纯水中(η=1.33), 通过将积分的光致发光强度和吸光度值与2-氨基吡啶进行比较, 测量N,S-CQDs量子产率, 其相对荧光量子产率(Φ, %)计算公式为

(1)

式中,Φ(%)为相对荧光量子产率;I为荧光发射峰的积分面积;A为荧光激发波长的紫外-可见光吸光度值;η(%)为折射率; 下标R是指量子产率的参考荧光物质.

1.4 细胞毒性实验

N,S-CQDs具有较低的细胞毒性和良好的生物相容性, 处理人类细胞24 h, 细胞存活率高于90%[21,22], 适用于人体组织, 但其环境毒性测试尚未见报道. 鉴于铜绿微囊藻(Microcystis aeruginosa, FACHB-905, 中国科学院水生生物研究所国家淡水藻种库)属湖泊、水库及其它水域生态系统中常见蓝藻, 以此为水生浮游生物模式, 测试N,S-CQDs的环境毒性. 藻种培养参照文献[24]方法, 每组设3个平行实验, 所有实验用容器、溶液、超纯水均作灭菌处理. 拟定对照组细胞的细胞存活率为 100%, 使用下式计算细胞存活率(Cell viability,%):

Cell viability=(ODtreated/ODcontrol)×100%

(2)

式中, ODtreated和ODcontrol分别代表实验组和对照组的藻体生物量, 即对应藻液在680 nm波长处的光密度.

1.5 胃液pH值检测

参照文献[25]方法配制含有机物、无机物和消化酶的人体胃液(pH=1.07±0.07, 4 ℃). 取9 mL胃液, 用HCl或NaHCO3溶液调节pH值(2.01, 2.26, 2.53, 2.76 3, 3.26, 3.53, 3.77, 3.99, 4.20, 4.54, 5.11), 加入N,S-CQDs溶液(10 mg/mL, 1 mL), 在λex=302 nm荧光激发下分别测定发射峰λem=409 nm处的荧光强度. 以荧光发射峰强度值(FL intensity)对pH值做线性拟合, 得到标准曲线方程式和相关系数(R2), 探究碳量子点对胃液pH值的响应情况.

1.6 金属离子对荧光检测干扰

金属离子可对N,S-CQDs荧光性能产生干扰[26,27]. 以0.5 mmol/L胃中常见金属离子(Na+, K+, Fe3+, Mn2+, Cd2+, Ca2+, Pb2+, Zn2+, Hg+, Co2+, Mg2+, Ni2+)为干扰物, 测试它们对N,S-CQDs的荧光响应. 鉴于胃癌组织中铁含量显著高于正常胃黏膜组织[28], 且主要以Fe(Ⅲ)存在, 实验进一步探讨了Fe(Ⅲ)浓度(0, 1, 2, 5, 10, 25, 50, 75, 100, 125, 150, 200, 250, 300, 400, 500 μmol/L)对N,S-CQDs(10 mg/mL, 1 mL)荧光性能的影响.

2 结果与讨论

2.1 N,S-CQDs的结构表征

由图1(A)的TEM照片可知, N,S-CQDs粒径均匀、分散性好、大致呈圆球状. 由粒径呈正态分布图[图1(B)]可见, 其平均粒径为6.69 nm. 由单纳米颗粒图像[图1(C)]可得碳量子点晶格间距为0.21 nm, 与石墨(sp2)碳的(002)衍射面几乎相同. XRD谱图[图1(D)]在约2θ=24.9°处出现一个典型的石墨结构特征峰[13], 进一步证实N,S-CQDs的结晶性较好.

Fig.1 HRTEM images(A, C), size distribution(B) and XRD pattern(D) of N,S-CQDs

Fig.2 FTIR spectrum of N,S-CQDs

Fig.3 XPS spectra of C1s(A), N1s(B), O1s(C) and S2p(D) of N,S-CQDs

Fig.4 UV-Vis absorption spectrum and fluorescence spectra of N,S-CQDs(A) and fluorescence spectroscopy of N,S-CQDs with different excitation wavelengths(B) Insets in (A) are photos of N,S-CQDs irradiated by natural light(left) and 300 nm UV light(right).

N,S-CQDs作为荧光探针, 实际环境中离子强度、抗光漂白性、荧光持久度、酸碱可逆性等均对其性能发挥起着至关重要的作用, 实验结果如图5所示. N,S-CQDs的荧光强度和光谱特征在0～2.0 mol/L NaCl介质中没有明显变化[图5(A)]. 当N,S-CQDs溶液的pH值分别为4.27, 7.42和8.88时, 紫外灯照射1 h其荧光强度的变化见图5(B), 发现其具有较强的抗光漂白性. 将pH值为4.27的N,S-CQDs溶液置于4 ℃冰箱内, 每隔30 d测量一次荧光光谱, 结果如图5(C)所示, 90 d后其荧光强度依然保持不变. 图5(D)表征了N,S-CQDs的pH可逆性, 用于评价N,S-CQDs在酸碱介质之间切换时的可逆行为. 用NaOH和HCl溶液调节pH值在2～8之间切换5次后仍表现出显著的pH可循环发光特性, 这表明N,S-CQDs具有极好的可逆pH性能. 总体来说, N,S-CQDs具有很高的光致发光稳定性, 是很有前途的荧光纳米传感材料.

Fig.5 Effects of NaCl concentration(A), irradiation time(B), storage time(C) and cycle number(D) on the fluorescence intensity of N,S-CQDs

2.2 浮游植物细胞毒性评价

利用铜绿微囊藻细胞实验评价了N,S-CQDs环境毒性. 图6结果表明, N,S-CQDs对藻细胞几乎没有毒性, 在高浓度(400 μg/mL)N,S-CQDs孵育铜绿微囊藻细胞48 h, 存活率仍达到82.8%. 说明N,S-CQDs对浮游植物细胞毒性低, 环境友好.

Fig.6 Survival rate of Microcystis aeruginosa cells cultured in N,S-CQDs with different concentrations for 0, 24 and 48 h

Fig.7 Effect of different metal ions on the fluorescence intensity of N,S-CQDsa. Blank; b. Na+; c. K+; d. Fe3+; e. Mn2+; f. Cd2+; g. Ca2+; h. Pb2+; i. Zn2+; j. Hg+; k. Co2+; l. Mg2+; m. Ni2+.

2.3 抗金属离子干扰性能

金属离子对基于N,S-CQDs荧光传感体系的干扰情况如图7所示; 大多数金属共存未引起N,S-CQDs荧光性能变化, 即N,S-CQDs抗金属离子干扰性强; 只有Fe(Ⅲ)离子能显著猝灭N,S-CQDs荧光, 这归因于Fe(Ⅲ)可与碳量子点表面的氨基、羧基配位, 破坏了辐射跃迁, 从而导致荧光猝灭[33].

Fe(Ⅲ)浓度与N,S-CQDs荧光猝灭程度间的关系如图8(A)所示. 随着Fe(Ⅲ)浓度增加, 在λex=302 nm下, N,S-CQDs荧光强度减弱. 如图8(B)所示, 在λem=409 nm处猝灭效率[(F0-F)/F0]与Fe(Ⅲ)浓度在2～150 μmol/L范围内呈良好线性关系(R2=0.995). 人体胃液中铁离子浓度约为2.15～9.83 μmol/L[37], 即使按最大浓度10 μmol/L计算, 且全部以Fe(Ⅲ)形态存在, 根据线性关系得出N,S-CQDs在胃液中荧光强度仍可保留91%以上, 胃液中铁离子所能引起的荧光猝灭有限, 对胃液中pH精确检测影响不显著, 即干扰效应可控.

Fig.8 Fluorescence emission spectra of N,S-CQDs with different concentrations of Fe(Ⅲ)(A) and the linear relationship between(F0-F)/F0 and Fe(Ⅲ) concentration(B)

2.4 N,S-CQDs对胃液pH值的检测

为评价N,S-CQDs荧光传感器检测人体胃液pH值的可行性, 配制不同pH值(2.01～5.11)全仿生胃液, 用在λex=302 nm下测定胃液荧光值. 如图9(A)所示, 在胃液中N,S-CQDs荧光强度随pH值的升高而逐渐增强, 说明N,S-CQDs对pH值敏感性强. 虽然胃液中N,S-CQDs荧光强度比有所减弱, 但其发射波长409 nm处的荧光强度与pH值在2.01～5.11范围内呈良好的线性关系, 相关系数为0.9931[图9(B)], 精度达到0.01级, 说明这种基于N,S-CQDs的荧光pH传感器能达到胃癌和新生儿胃功能诊断要求, 为胃液pH值实时、原位监测提供可能.

Fig.9 Influence of pH value on the fluorescence intensity of N,S-CQDs in gastric juice(A) and the linear relationship between FL intensity at 409 nm and pH value(B) pH: a. 2.01; b. 2.26; c. 2.53; d. 2.76; e. 3.00; f. 3.26; g. 3.53; h. 3.77; i. 3.99; j. 4.20; k. 4.54; l. 5.11.

Fig.10 Zeta potential of N,S-CQDs

表面态、量子效应和碳核是影响碳量子点性能的主要因素[21]. 羧基在酸性溶液中可被质子化, 从而导致碳量子点聚集, 引起荧光猝灭, 也即pH值越小, 荧光强度越弱. 而且在低pH值条件下, N,S-CQDs表面氮以氨基形式存在, 氨基的钝化效果比较敏感. 因此, 从图9(A)看出荧光峰的位置随着pH值的降低发生明显的移动. 结合FTIR和XPS表征结果认为, N,S-CQDs荧光的pH响应性可能与其表面基团的质子化或去质子化有关[23,38]. 为了进一步验证, 测试了不同pH值下N,S-CQDs溶液的Zeta电位. 结果如图10所示, N,S-CQDs溶液在低pH值的, 其表面电位为正值, 随着pH值不断升高, 其表面成负电性, 且绝对值不断增大.

本文制备的N,S-CQDs和已报道碳量子点的pH荧光探针性能数据列于表1. 可以看到, 本文制备的N,S-CQDs在原材料成本、量子产率和胃环境适应性等方面优势明显.