正交试验法优选脐橙果皮中柠檬烯的超临界流体CO2萃取工艺

李 运，白贺明，朱仁愿，邱国玉

（兰州市食品药品检验所，甘肃 兰州 730050）

柠檬烯在天然植物中存在3种异构体，最普遍的是D-柠檬烯，富含于芸香科（Rutaceae）柑橘属(Citrus L.)植物的果皮精油中。柠檬烯属单萜类化合物，呈橙红、橙黄色或无色澄清液体，有特异香气；具有利胆溶石、理气开胃、消炎止痛之功效，其制剂在临床上用于治疗胆道疾病[1]，国内有十余家制药企业生产相关制剂，具有极大的临床应用潜力。现代药理研究表明，D-柠檬烯具有抑菌[2]；调节脂质代谢紊乱[3]；抑制癌细胞增殖，诱导细胞凋亡[4-8]；镇痛及促进神经中枢维持觉醒作用[9]；同时，能够促进盐酸川芎嗪的透皮吸收[10]。目前，脐橙皮多被人们当垃圾丢弃，其宝贵的应用价值被忽视，从脐橙皮中提取D-柠檬烯可使资源再生，变废为宝。柠檬烯多通过水蒸气蒸馏、分子蒸馏[11]、溶剂浸提等方法进行提取。本试验以脐橙皮粗粉为研究对象，柠檬烯萃取率为评价指标，采用正交试验优选CO2超临界萃取最佳工艺，为该资源的开发利用提供参考依据。

1 材料

Spe-ed型超临界萃取仪（美国应用分离公司），GC-2010 Plus气相色谱仪 （日本岛津公司），MS105DU型电子天平（梅特勒-托利多仪器（上海）有限公司），BSA224S-CW型电子天平 (赛多利斯科学仪器（北京）有限公司)，CBL-10DT超声波恒温清洗机 （宁波新芝生物科技股份有限公司），DGG-9140B型电热恒温鼓风干燥箱 （上海森信实验仪器有限公司）。

脐橙购自江西赣州市，经兰州大学药学院杨永建教授鉴定为芸香科植物脐橙Citrus sinensis(L.)Osbeck的新鲜果实。去除果肉，将其果皮在日光下自然晒干，粉粹，过3号筛，备用。

柠檬烯对照品 （中国食品药品检定研究院，批号 100470-201302，纯度：96.0%），无水乙醇（国药集团化学试剂有限公司）。

2 方法与结果

2.1 超临界萃取工艺

称取脐橙皮粉末适量，置提取釜中，连接管路，确保气密性良好。设置萃取压力、炉体温度、出样阀温度，开机萃取，提取完成后从出样阀获得黄色液体状提取物，称定其重量。取适量，用无水乙醇溶解定容于25mL容量瓶，待上机测试。

2.2 柠檬烯的含量测定

2.2.1 对照品溶液的制备

精密称取柠檬烯对照品181.41mg，置于100mL容量瓶中，加无水乙醇定容，摇匀，即得。

2.2.2 色谱条件

Rtx-Wax弹性石英毛细管柱（0.32mm×30m，0.25μm）；柱温：45℃；载气：高纯氮气；进样口温度：220℃；色谱柱流量：1.38mL·min-1； 检测器温度：220℃； 进样量：1μL；分流比：30：1。 理论塔板数按柠檬烯峰计算应不低于30000。色谱如图1所示。

2.2.3 供试品溶液的制备

精密称取超临界萃取物0.0500g，置25mL容量瓶中，用无水乙醇定容至刻度，摇匀，0.45μm微孔滤膜滤过，取续滤液，即得。

2.2.4 线性关系考察

精密吸取柠檬烯对照品溶液 0.1，0.2，0.4，0.8，1.0，2.0，5.0mL，分别置于25mL容量瓶中，用无水乙醇稀释至刻度，摇匀，0.45μm微孔滤膜滤过，取续滤液，按2.2.2项下条件测定，以对照品溶液浓度为横坐标，峰面积为纵坐标，得回归方程Y=565710X+41.8416（r=0.9999），线性范围 0.003483～0.348308mg·mL-1。

图1 空白试剂（A）、对照品（B）、供试品（C）的气相色谱图1.柠檬烯

2.2.5 精密度试验

取浓度为0.055729mg·mL-1的柠檬烯对照品溶液，按2.2.2项下条件连续进样6次，分别记录峰面积，计算RSD为0.56%，表明仪器的精密度良好。

2.2.6 稳定性试验

取“2.2.3”项下同一份供试品溶液，室温下放置，0、2、4、6、12、18、24h 分别按“2.2.2”项下条件进行测试，计算出目标峰积分面积值的RSD为1.1%，可见供试品溶液至少在24h内稳定。

2.2.7 重复性试验

精密称取同一份超临界萃取物5份，每份0.0500g，按2.2.3项下方法制备供试品溶液，按“2.2.2”项下条件进行含量测定。结果柠檬烯平均含量为16.9mg·g-1，RSD为1.2%，说明该方法重复性良好。

2.2.8 加样回收率试验

精密称取已知含量的超临界萃取物6份，每份60mg，分别精密加入柠檬烯对照品溶液（0.013932 mg·mL-1）2.0mL，置 25mL 容量瓶中，按“2.2.3”项下方法制备供试品溶液，在上述色谱条件下进行分析测定，计算回收率。结果柠檬烯平均回收率(n=6)为98.5%，RSD为1.7%。

2.2.9 样品测定

取供试品溶液，分别进样1μL，记录柠檬烯峰面积，外标法计算含量。

2.3 正交试验设计[12]

准确称取脐橙皮粗粉10.00g，置超临界萃取釜中进行萃取。在预实验的基础上，设定出样阀温度为100℃，选择萃取温度、萃取压力、萃取时间为考察因素，每个因素设定3个水平，以柠檬烯萃取量为评价指标，因素水平见表1，试验安排及结果见表2，方差分析见表3。

表1 脐橙皮中柠檬烯提取CO2超临界萃取工艺正交试验因素水平

直观分析表明各因素对萃取工艺的影响程度依次为C＞A＞B；方差分析表明C因素对超临界萃取工艺的评价指标有显著性影响，A，B因素则无显著性差异。确定最佳工艺条件为A2B2C3，即萃取温度为40℃，萃取压力为200bar，萃取时间为6h。

2.4 验证试验

取同批次样品3份，按优选的最佳提取工艺进行验证试验，测定柠檬烯的萃取率。结果提示柠檬烯的平均萃取率为18.70mg·g-1，RSD2.4%，说明优选的工艺条件稳定可行。

表2 脐橙皮中柠檬烯提取CO2超临界萃取工艺正交试验结果

表3 柠檬烯萃取率方差分析

3 讨论

1）夹带剂的应用。考察了以无水乙醇、甲醇作夹带剂，对萃取率的影响。结果显示，夹带剂的应用，对于改变柠檬烯的萃取率无显著性，故本研究在萃取工艺中未加入夹带剂。

2）提取方式的选择。柠檬烯较常用的是水蒸气蒸馏法和有机溶剂浸提法，但这两种方法受提取过程较高温度的影响，会使精油中热敏性化合物受热分解或水解，降低了精油内在品质，造成馏分损失和有机溶剂残留、萃取时间长、效率低等不足之处。而采用超临界流体萃取技术，具有操作温度低、有效成分不易被分解破坏、提取率高、无溶剂残留等优点，是“绿色化学”所倡导的技术。

3）以脐橙中精油为研究对象，进一步开展相关药理活性研究，拓宽其应用空间，将提高该资源的深度开发利用，使其真正变废为宝。