一株侧耳属野生菌的分离鉴定及初步驯化栽培

晚安琪，蔺晓云，黄亮，班立桐，孙宁，王玉，李奕葶

一株侧耳属野生菌的分离鉴定及初步驯化栽培

晚安琪，蔺晓云，黄亮通信作者，班立桐，孙宁，王玉，李奕葶

（天津农学院 农学与资源环境学院，天津 300384）

从天津宝坻区采集了一株野生真菌，对其进行分离鉴定。通过提取供试野生菌株的基因组，对其18S rDNA序列进行了扩增、测序，将所测的基因序列提交到GeneBank中进行 BLAST 比对，选取相似性较高的菌株，构建出系统发育树。利用18S rDNA序列分析法与传统分类法相结合的方法，鉴定出该野生真菌属担子菌纲（Basidiomycetes），伞菌目（Agaricales），侧耳科（Pleurotaceae），侧耳属（），为平菇菌株。进一步采用瓶栽技术驯化栽培子实体获得成功，平均有效生物学转化率可达50.4%。

平菇；18S rDNA鉴定；系统进化树；驯化栽培

平菇（）学名侧耳，属担子菌纲（Basidiomycetes），伞菌目（Agaricales），侧耳科（Pleurotaceae），是我国栽培面积最大的食用菌[1-2]。其野生菌株生长在春秋季节阔叶树林的枯木上，生长温度范围宽泛，在我国大部分地区均有分布[3]。平菇营养丰富、口味鲜美，具有多种药理活性及临床功效，是食药两用菌，具有广阔的消费市场及开发前景[4-9]。平菇在20世纪30年代即实现了人工栽培，目前在许多国家均有栽培，我国平菇栽培量居世界第一位。平菇瓶栽工厂化生产可实现四季栽培，有望替代传统塑料袋栽培，而一潮菇产量较高的菌株，将有利于提高设备及厂房的利用率。

作者于天津市林木种苗示范基地的马家店槐树枯死树上采集到疑似野生平菇，通过组织分离获得该野生真菌的菌丝培养物，进一步提取子实体及菌丝体的基因组DNA，进行18S片段的测序及系统发育分析，确定种属后进行初步瓶栽驯化栽培。本研究将为该野生平菇的开发研究奠定基础，也将促进天津市食用菌种质资源库的建设。

1 材料与方法

1.1 试验材料

1.1.1 供试菌株

供试野生菌株样品于2017年采集于天津市林木种苗示范基地马家店槐树枯死树上，利用组织分离法获得斜面菌丝体，命名为TN02。

1.1.2 培养基

斜面PDA培养基：马铃薯200 g，葡萄糖20 g，琼脂20 g。

栽培料配方：棉籽壳45%、木屑45%、麸皮9%、石灰1%，加水搅拌至含水量65%。

1.1.3 引物

采用真菌鉴定通用引物扩增18S rDNA序列。NS1（5’-GTAGTCATATGCTTGTCTC-3’），NS6 （5’-GCATCACAGACCTGTTATTGCCTC-3’）。

1.2 试验方法

1.2.1 子实体形态特征观察

对供试子实体生长环境及其形态、颜色特征进行观察、拍照，并结合相关文献，初步鉴定其科分类地位。

1.2.2 菌丝DNA提取及PCR扩增

按照Ezup柱式真菌基因组 DNA 抽提试剂盒说明书进行菌丝DNA提取，PCR扩增后用pMD®18-T Vector 连接试剂盒进行克隆测序。

1.2.3 系统发育分析

将测定的18S rDNA 序列提交至NCBI数据库进行比对，查找同源相似性高的序列，利用MEG7.0构建系统发育树。

1.2.4 平菇驯化栽培

采用850 mL培养瓶进行驯化栽培，每瓶干料质量约175 g。菌瓶长满后，转至岀菇室开盖直立培养，出菇温度15～18 ℃，空气相对湿度85%～90%，每24 h照明12 h，只采收第1茬鲜菇并计算产量。

2 结果与分析

2.1 子实体生态环境调查及形态鉴定

供试野生真菌样品TN02采集于天津市宝坻区林木种苗示范基地，形态特征如图1所示。由图1可见，子实体叠生，菌盖呈扇状，灰色至褐色，直径2～7 cm，最大11 cm，厚度0.3～0.8 cm；菌褶致密，延生不分叉；菌柄侧生，白色，内实，基部有少量绒毛，初步鉴定其为侧耳属。

图1 野生真菌TN02子实体的形态照片

注：a. 野生状态；b. 子实体正面；c. 子实体反面

2.2 菌丝DNA提取及PCR扩增

将提取的菌株基因组DNA片段经电泳检测后在凝胶成像系统拍照，观察其基因组DNA电泳图谱呈单一清晰的条带（图未列出）。以NS1、NS6 为引物对基因进行扩增，电泳后出现了清晰明亮的单一条带，结果如图2所示，所得产物片段大小为1 200～1 500 bp。

图2 PCR扩增18S rDNA序列产物电泳图

注：M为Marker；P为PCR产物

2.3 TN02平菇系统进化分析

将PCR扩增产物进行克隆测序，得到的序列长度为1 321 bp，在GenBank中的登录号为MN068914。进一步进行系统进化分析，获得进化树，见图3。

图3 TN02平菇18S rDNA 序列系统发育树

从进化树（图3）可以看出，TN02与FJ379284.1的基因片段相似度达99%，遗传距离最近；形态学特征鉴定结果和BLAST比对结果一致，鉴定菌株TN02为平菇（）。

2.4 菌丝体培养及驯化栽培

将组织分离的TN02菌株进行平板培养，14 d左右即铺满平板，菌丝生长速度为0.66 cm/d。对6瓶岀菇后的子实体农艺性状进行了调查，结果 见表1。

表1 TN02子实体农艺性状

由表1可见，出菇试验均获得了子实体，但整齐度不高。第5瓶和第6瓶由于岀菇个数较少，导致最终产量偏低（图4）。以第1～第4瓶为有效岀菇瓶，平均生物学转化率为50.4%，相当于康源春等[10]研究中的平菇七至八成熟的水平。由于本试验中装料位置距瓶口3～4 cm，子实体在生长期间所处微环境的CO2体积分数偏高，获得的平菇菌柄偏长（平均11.6 cm）。人工栽培的子实体形态与野生子实体形态差别很大，表明该平菇菌株具有较好的环境适应能力，也说明环境控制是改变子实体农艺性状的重要手段。

注：a. 岀菇培养14 d；b. 岀菇培养16 d；c. 第2瓶子实体；d. 第5瓶子实体

3 讨论与结论

编码rDNA的序列分析可用于未知微生物的鉴定或者对表型鉴定结果进行验证，应用非常广泛[11-13]。18S rDNA序列高度保守，常用来分析物种系统进化关系，具有很好的通用性，在GeneBank中数据源丰富，利用其鉴别菌株在一定范围内更具准确性。

综合菌株的生态环境及其形态特征，再根据18S rDNA序列比对结果，参照系统进化树可鉴定出该野生真菌属担子菌纲（Basidiomycota），伞菌目（Agaricales），侧耳科（Pleurotaceae），侧耳属（），为平菇菌株。经初步驯化栽培可知，该平菇菌株具有较好的环境适应能力，瓶栽平均有效生物学转化率可达50.4%，具有进一步人工栽培驯化的潜力。菌种质量是影响食用菌生产的关键因素[14]。平菇为大众菇种，天津市主栽品种大多来源于南方，品质参差不齐，菇农对平菇的管理大多依靠经验；天津存在众多的菌菇资源可以开发利用（如苇蘑[15]）。本研究从当地分离到的菌株培养温度为15 ℃左右，适合北方气候特点，且生长速度较快，管理简单，驯化后有较好的推广价值。

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Identification and cultivation of a wild

WAN An-qi,LIN Xiao-yun, HUANG LiangCorresponding Author, BAN Li-tong, SUN Ning, WANG Yu,LI Yi-ting

（College of Agronomy and Resources Environment, Tianjin Agricultural University, Tianjin 300384, China）

The object of this paper was to isolate and identify a wild fungus which was obtained from Baodi district, Tianjin city. The genomic DNA of the wild fungus was extracted and used as templates for the 18S rDNA gene PCR amplification. The 18S rDNA gene fragments were sequenced later. Multiple sequence alignmentwas operated by BLAST in GeneBank. Then other known species with high homology were used for the phylogenetic tree construction. By the 18S rDNA sequence analysis combined with morphological classification,results showed that the fungus belonged to the Basidiomycetes, Agaricales, Pleurotaceae,. The fruiting body was cultivated successfully and the average biological efficiency of the first harvest was 50.4%.

; 18S rDNA; phylogenetic trees; artificial cultivation

1008-5394（2020）02-0028-03

10.19640/j.cnki.jtau.2020.02.006

S646

A

2019-11-24

大学生创新创业训练计划项目（201810061121）；天津市蔬菜产业技术体系创新团队项目（ITTVRS 2017015）

晚安琪（1998-），女，本科在读，研究方向为菌类作物。E-mail：920720136@qq.com。

黄亮（1983-），男，副教授，博士，主要从事生物发酵及食用菌栽培。E-mail：huangliang@tjau.edu.cn。

责任编辑：宗淑萍