脂肪肝及其恶变的过食高脂诱发

张艺文，黄夏伶，李玉桑

中南民族大学药学院，湖北 武汉 430074

肝脏是代谢稳态的中心器官，也是碳水化合物、蛋白质和脂质等大量营养素的代谢、合成、储存和重新分布的主要部位［1］。近年来随着人们饮食结构的变化，速食节奏养成的不良饮食习惯，加上过量摄入高脂食物不加以节制，导致过多的脂肪蓄积对肝脏造成负担，最后诱发脂肪肝。如何更加深入认识脂肪肝，并阻止其进一步恶变成了迫在眉睫的任务。

非酒精性脂肪肝病（non alcoholic fatty liver disease，NAFLD）是最常见的肝病［2］，在全球范围内影响22%至28%的成年人和50%以上的肥胖人群［3］。早期NAFLD难以察觉，若不给与有效的手段防治，可能会发展为非酒精性肝炎，而后经历肝纤维化到肝硬化的各个阶段，并可能并发肝细胞癌［4-5］，目前NAFLD已成为饮食丰富的社会中最主要的死亡诱因之一［6］。临床研究和动物实验表明在NAFLD的发生过程中，甘油三酯在肝细胞内的蓄积是诱发脂肪肝的必要条件［7-9］。

非酒精性脂肪肝对公众健康的影响越来越大，但目前可供临床治疗有效选择尚无，也没有美国食品和药物管理局（Food and Drug Administra⁃tion，FDA）批准的疗法。究其原因，可考虑为缺乏符合临床药物研发所用的动物模型［10］。在本研究中，我们结合前期肝细胞内脂肪蓄积的细胞模型和临床脂肪肝的病理特征，模拟人们日常的高脂饮食结构，选择脂肪供能比为60%的高脂饲料喂养，构建了小鼠的脂肪肝模型，探究过食高脂对小鼠脂肪肝及其恶变的影响，为开发安全有效的防治非酒精性脂肪肝病药物提供新思路。

1 实验部分

1.1 主要试剂与仪器

二甲苯（国药集团化学试剂有限公司），无水乙醇（国药集团化学试剂有限公司），苏木精（美国Sigma-Aldrich公司），伊红（美国AMRESCO公司），H2O2溶液（国药集团化学试剂有限公司），柠檬酸钠（国药集团化学试剂有限公司），兔HIF-1α多克隆抗体（英国Abcam公司），羊COX-2多克隆抗体（英国Abcam公司），兔p16多克隆抗体（英国Ab⁃cam公司），兔p21多克隆抗体（英国Abcam公司），羊抗兔IgG（武汉博士德生物工程有限公司），兔抗山羊IgG（武汉博士德生物工程有限公司），兔血清（武汉博士德生物工程有限公司），山羊血清（武汉博士德生物工程有限公司），组织甘油三酯酶法测定试剂盒（北京普利莱基因技术有限公司）。

TP1020型莱卡组织脱水机（德国Leica公司），EG1150H型莱卡组织包埋机（德国Leica公司），RM2265型莱卡石蜡切片机（德国Leica公司），5804R型低温高速离心机（德国Eppeddorf公司），Ti-E/U/SEclipse型系列显微镜（日本Nikon公司），Infite200型多功能酶标仪（瑞士Tecan公司），CRi Nuance型多光谱显微成像系统（美国PerkinElmer公司），Nuance型多光谱定量仪（美国Cambridge Research and Instrumentation公司）。

1.2 动物模型建立

将60只雄性昆明小鼠（体重约20 g，购于湖北省实验动物中心）饲养在中南民族大学药学院SPF级动物饲养中心；适应1周后，将小鼠随机分为两组，空白组与模型组，每组各30只。空白组（Con⁃trol）以脂肪供能比为10%的普通饲料喂养；模型组（Model）脂肪供能比为60%的高脂纯化饲料喂养。自由饮水，分别在第10、20、25周时，每组各取10只小鼠处死并进行相关检测。本实验在严格执行《关于善待实验动物的指导性意见》［11］，完成实验全程记录体重以及行为变化。

1.3 肝脏甘油三酯含量的测定

精确称重肝脏组织50 mg，按比例向肝组织加入裂解液（1 mg/20μL），高速匀浆后静置。取上清液，70℃加热10 min，再在室温2 000 r/min离心5 min，再取上层清液，使用甘油三酸酯试剂盒，通过酶标仪进行含量测定。

1.4 HE染色

将肝脏组织置入质量分数10%福尔马林中固定48 h，然后进行处理并包埋成石蜡块；将包埋好的组织切成2μm的切片，并依次通过二甲苯、梯度酒精、蒸馏水中脱蜡，随后再浸入苏木素中染色3 min、温水返蓝5 min、伊红染色40 s。最后过梯度酒精完成脱水，在二甲苯中浸泡0.5 h之后，即可封片进行病理学分析。

1.5 免疫组织化学染色法

将已制作完成的肝组织石蜡切片依次放入二甲苯、梯度酒精、蒸馏水进行脱蜡，并在质量分数3%过氧化氢中孵育10 min，使内源性过氧化物酶失活；接着放入柠檬酸钠缓冲溶液微波加热至沸腾10 min，用以修复抗原。放置冷却到室温后血清孵育1 h，之后将切片与特异性抗体在4°C下过夜；第二天滴加二抗继续孵育1 h，再用DAB进行发色，镜检情况良好则可放入苏木素溶液复染，盐酸乙醇分化；最后封片在显微镜下观察并用多光谱定量。

1.6 统计分析

使 用 GraphPad Prism 5.0.1（GraphPad Soft⁃ware，Inc.）软件进行统计分析。数据表示为Mean±SD并进行Tukey事后检验，P＜0.05的概率值被认为是重要的。

2 结果与讨论

2.1 高脂饮食对小鼠大体观的影响

图1是高脂饮食对小鼠体重和外观的影响。由图1（a）我们可以发现模型组小鼠一直维持较高水平增长体重，但是空白对照组小鼠体重在前五周有明显增长后趋于较缓慢增长，并始终与模型组有差距。从图1（b）可知空白组小鼠的体型偏小，皮毛顺滑，有光泽，模型组小鼠体型偏大，还存在皮毛枯燥情况。另外，根据日常行为学记录可知空白对照组小鼠活动正常，但是模型组小鼠蜷缩，不活跃。

2.2 高脂饮食对小鼠肝组织的病理学影响

图2是过食高脂10周、20周、25周后小鼠肝组织病理学的检测图片。从图2（a）可观察到空白组小鼠肝脏表面光滑，色泽鲜红，而模型组小鼠肝脏整体发黄、体积增大、切面油腻，25周情况尤为明显，且出现肉眼可见白色结节。从图2（b）HE染色结果显示空白对照组肝细胞形态正常，细胞核与细胞质染色清晰；模型组小鼠肝组织出现了脂肪空泡，肝细胞结构紊乱，呈现气球样变，随过食高脂时间的增加而脂肪化渐渐严重。图2（c）结果显示，10周两组差异不大，20周时，与空白对照组相比，模型组小鼠肝组织内甘油三酯水平升高，具有显著性差异，但在25周甘油三酯水平出现下降趋势，预测是因为脏器衰竭，导致肝脏代谢出现问题。以上结果表明了过食高脂促使肝脏中脂质蓄积增加，引起明显的肝组织病理学改变，诱发了脂肪肝。

2.3 过食高脂对肝损相关蛋白（COX-2、HIF-1α、p16、p21）表达的影响

图1 高脂饮食对小鼠体重和外观的影响：（a）体重增长图，（b）小鼠外观图Fig.1 Effect of high-fat diet on body weight and appearance of mice：（a）body weight during experiment，（b）appearance of mice

图3是过食高脂后不同时间点的小鼠肝损相关蛋白的表达结果。图3（a）是小鼠分别在10、20、25周肝组织免疫组织化学染色照片，图3（b）是免染的对应定量结果，从组中可以看出，在10周两组差别不大，但从20周开始，炎症标志物COX-2和低氧诱导蛋白HIF-1α在高脂组小鼠肝细胞质中表达明显增多；定位于细胞核内的细胞衰老生物标志物p16在高脂组中入核明显，核表达定量结果表明高脂组远远高于普通组，具有显著性差异。细胞周期蛋白的激酶抑制因子p21，在25周时高脂组蛋白水平显著升高。这些肝脏损害的蛋白标志物的升高，均提示高脂饮食诱发的脂肪变性可恶化正常肝细胞的生存微环境，为促进脂肪肝恶变提供了机会。

图2 过食高脂对小鼠肝组织的病理学影响：（a）小鼠肝脏外观，（b）小鼠肝脏HE染色，（c）小鼠肝内甘油三酯水平Fig.2 Effects of high-fat diet on liver histopathology in mice：（a）overviews of livers in mice，（b）pathological changes of liver tissues stained with HE，（c）triglyceride levels in liver tissues of mice

图3 过食高脂对小鼠肝脏中COX-2、HIF-1、p16、p21蛋白表达影响：（a）蛋白免疫组织化学染色图片，（b）蛋白多光谱定量图Fig.3 Effect of high-fat diet on expression of COX-2，HIF-1，p16，p21 protein in liver of mice：（a）representative images of protein expression ，（b）quantification of（a）using multispectral image analysis

2.4 讨 论

近年来NAFLD的全球流行率呈逐渐上升的趋势，并已经成为临床上常见慢性疾病之一。受当代社会过快的生活节奏和不良的饮食习惯影响，食物中脂肪的过度摄入和缺乏运动的生活方式被认为是造成肥胖和相关代谢性疾病流行的主要原因之一。研究发现，过多的脂肪摄入是脂肪肝疾病的诱因之一［12］，体内脂质积累已被证实与脂肪肝的发生、发展有关［13］。本研究以昆明小鼠为研究对象，模拟人类高脂饮食而引起的非酒精性脂肪肝病，采用高脂饮食喂养小鼠10、20和25周后建立不同时期非酒精性脂肪肝病模型。以期通过本研究为预防NAFLD的恶化提供新的治疗思路。

在本实验中，发现持续高脂饮食使小鼠体重大幅度增加，并且对小鼠生理状态产生了影响。从肝脏大体形态观察结果来看，与空白对照组相比，模型组的肝脏体积有所增加，整体颜色呈淡黄色。随高脂饲养时间的增加病变程度逐渐严重，甚至在25周时出现白色肿瘤结节。小鼠肝组织切片HE染色提示了高脂饮食造成肝组织脂质蓄积，肝脏细胞呈气球样变［14-15］，细胞结构紊乱。甘油三酯在20周有了明显差异，但由于后期肝脏恶变导致脏器衰竭，代谢出现问题，所以25周无明显差异。以上结果表明喂养的时间增加，脂肪化程度加重，并有进一步恶变的可能。

大量研究表明：脂质一旦积累过度，便会激活低氧诱导蛋白HIF-1α，它在细胞氧信号起关键转录调节作用，通过启动其下游靶基因使肿瘤细胞增殖、转移及侵袭力增强，诱导血管新生病变，重塑肿瘤微环境［16］。随着时间推移，在高脂组中HIF-1α蛋白异常上调，肝脏微环境遭受破坏。另一方面当脂质过多沉积于肝脏细胞，低氧状态易引发氧化应激，损伤DNA，造成细胞老化。作为细胞老化的标志物p16和p21都直接参与细胞周期调控，影响细胞增殖及分裂［17］。从结果可知p16与p21蛋白在高脂组中均出现不同程度的表达量增多，表明细胞老化严重，他们的失活将引起细胞恶性增殖。不能马上死去的老化细胞，会分泌促炎因子COX-2，进而推动肝纤维化进程［18-19］。结果证实20周高脂组COX-2蛋白表达增加，并随时间增加炎症浸润越来越严重。以上结果提示持续长期高脂饮食增加肝脏细胞的损伤程度，破坏细胞的正常生长周期，使细胞恶变微环境形成，促进脂肪肝恶变，甚至成癌。

3 结 论

过食高脂不仅可诱导肝脏脂肪变性，还会激活低氧蛋白表达，破坏肝细胞线粒体的结构和功能，加重缺氧微环境的形成，细胞周期蛋白失活，导致细胞恶性增殖，促使炎症因子和癌变细胞因子分泌，成为恶变成肿瘤的强大促进剂。脂肪肝的恶变与 COX-2、HIF-1α、p16、p21等蛋白的过表达密切相关，可以作为研究脂肪肝恶变的新方向。