结构光照明显微镜的实验教学设计

缴 莉，刘如明，龙加福，周 颖

（南开大学生命科学学院，天津300071）

0 引 言

显微镜教学是现代生物学教学课程中的重要组成部分，是培养学生实践能力、科研思维的重要教学环节。随着科学技术的发展，越来越多的大型仪器出现并应用于科学研究中，如激光扫描共聚焦显微镜、双光子显微镜、超高分辨显微镜等。这些大型仪器具有构造精密、操作复杂、运行维护成本高等特点，在实验教学中通常只进行演示实验，很少开放让学生独立操作［1-2］。对此，我校生命科学学院公共实验平台显微成像仪器室在大型仪器实验教学方式上进行了积极的思考与探索。本文将以大型精密仪器结构光照明显微成像系统Delta Vision OMX SR为例，介绍OMX SR的工作原理和应用进展，详细描述该显微镜的实验教学课程设计内容。

1 结构光照明显微镜及其在生物学中的应用

1.1 结构光照明显微镜

结构光照明显微镜（SIM）是超高分辨显微镜的一种类型，结构光就是改变了空间结构的特殊调制光源。早在1999 年，Heintzmann 等［3］首次发表了用调制光照明样品并获得超分辨图像的文章。在此基础上，Gustafsson［4-5］实现了经典的二维结构光照明显微成像技术2D-SIM。到2008 年，SIM 被成功应用到三维空间，实现了3D-SIM。至此，线性荧光激发的结构光照明技术将成像的空间分辨率提高了两倍［6-7］。在2012年，Rego等［8］又用非线性结构光激发样品并成像。与线性结构光照明显微成像相比，非线性结构光照明显微成像的分辨率进一步提高［9］。

光的衍射极限限制了光学显微镜成像分辨率的提高。根据光学传递函数，显微系统只能接收样品中低频信息，代表细节的高频信息将被滤除。结构光照明显微镜的成像原理是利用改变了空间结构的特殊调制光源照明样品。根据莫尔条纹的原理，当调制光场的高空间频率信息和样品的高空间频率信息相叠加时，这两种高频信息将被编码成可以被探测、解析的低频信息。已知调制光也就是其中一个高频信息的参数包括入射角度、相位和光强分布，也已知叠加后的低频信息。通过特定的计算机算法，样品中代表细节的高频信息就从探测到的低频信息中解析出来，从而实现了显微成像分辨率的提升［10］。

1.2 结构光照明显微镜在生命科学研究中的应用

结构光照明显微镜出现后被广泛用于细胞内精细结构、蛋白精确定位和活细胞动态观测等研究中。利用结构光照明成像技术，科学家们在亚细胞水平的研究有了新的发现和进展。

在研究细胞精细结构方面，2015 年，Mönkemöller等［11］联合使用3D-SIM 和dSTORMDE 清晰地解析了肝窦内皮细胞的结构。2017 年，Hong 等［12］用突触前标记物突触小泡蛋白和突触后标记物PSD-95 标记了神经元，通过3D-SIM成像，成功解析了神经元突触的精细结构。2017 年，Yadav 等［13］用3D-SIM 成功观测到了血小板中的颗粒成分α-Granules。α-Granules 是血小板内部存在的颗粒成分，其平均直径190 nm，长340 nm，彼此间距为20 ～50 nm。2018 年，Sawada等［14］用3D-SIM结合新的样品处理方式，成功获得了小鼠脑切片中树突精细结构的图像。

在研究蛋白定位方面，Roth等［15］研究了有丝分裂过程中凋亡抑制蛋白Survivin 的定位机制，利用3DSIM模式采集图像后发现Survivin 的位置变化受到纺锤体的控制。Sternemalm［16］将SIM应用于小鼠肝脏肝窦内皮细胞中膜和细胞骨架联系的研究中。肝窦内皮细胞负责调节血流和周围组织中的物质交换，肝窦内皮细胞有很多大小不等的窗孔，窗孔直径50 ～200 nm。桥粒是重要的细胞间连接结构，其直径小于1 μm，细胞膜间间隙约为35 nm。在3D-SIM 模式下，Sternemalm发现CSPP-L 位于肝窦内皮细胞中桥粒致密斑的位置。2018 年，Pinnington 等［17］通过SIM 和单分子定位联用研究了肿瘤细胞中树突状伪足的形成机制。SIM 也被用于植物领域的研究工作中，Lambing［18］用3D-SIM解析了拟南芥减数分裂过程中的联会复合体结构动态变化，发现PCH2 出现在联会复合物集结处。

与其他超分辨显微镜相比，SIM对样品光损伤小、拍摄速度快，因此在活细胞观测中有着优势。Turnbull等［19］用SIM 研究了细菌Pseudomonas aeruginosa膜囊泡的形成机制和功能。细菌膜囊泡大小为50 ～250 nm，对3D-SIM观察到的膜囊泡进行测量，发现SIM观测到的膜囊泡直径大小在150 ～300 nm。膜囊泡的产生是快速的动态变化过程，这对仪器的稳定性和速度要求很高。在3D-SIM 模式下进行时间序列扫描，发现膜囊泡在细胞裂解过程中产生。SIM时间序列扫描也被用于研究HeLa细胞中线粒体-溶酶体结合的动态变化过程［20］。在植物领域，SIM 时间序列扫描已被用于研究拟南芥多个组织和器官中微管的动态变化，包括微管的形成、分支、生长和衰退等过程［21］。

2 结构光照明显微成像系统的实验教学设计

结构光照明显微成像系统DeltaVision OMX SR属于大型仪器，其构造精密，操作步骤较复杂。合理的实验教学设计是开展有效实验教学的关键。

2.1 理论课程设计

首先，在理论课程上对SIM的成像原理和结构组成进行系统的介绍。在教学中，让学生掌握扎实的理论知识是开展实验课程和自主实验设计的重要基础，充分理解仪器的运行原理不仅能帮助学生更好地学习实验技术，还能避免一些不规范的操作行为。接着，借助多媒体教学，图文并茂地介绍SIM在动物、植物、微生物、材料科学等研究领域中的应用案例，让学生明白SIM在科研中的重要作用和应用范围。在教学PPT中加入大量的显微拍摄图像和时间序列扫描视频，着重展示结构光照明显微镜图像、激光扫描共聚焦显微图像、宽场图像之间的区别。通过理论课程，让学生掌握SIM的原理，了解其应用范围，同时激发学生的学习兴趣。

2.2 实验课程设计

（1）小组教学。大型精密仪器对操作者的实验技能要求较高，操作不当容易损坏仪器、造成损失。因此，在实验技术训练过程中，宜采取小组为单位的教学形式，根据专业或课题将学生分组，每组不超过10 人。小组教学的优点有，①能保证每个同学都有动手操作的机会；②教师能针对每个学生的操作进行指导，可以及时纠正错误操作；③利于教师维护仪器。

（2）开关机教学。DeltaVision OMX SR硬件组成主要包括电源、激光器、相机、显微镜、图像采集工作站和图像处理工作站。大型仪器的开关机顺序复杂，激光器和相机等消耗性部件的使用和开关机要进行重点教学。错误的开关机顺序会导致图像采集失败，严重的情况会对仪器造成损耗。因此，开关机教学中要求学生一定严格按照要求进行操作，重点记忆激光器、相机等部件的使用规范。

（3）镜油的选择。SIM 采用结构光照明，使用正确折光率的镜油才能得到好的实验结果。因此，镜油的选择至关重要。DeltaVision OMX SR配有一个63 ×油镜（1.42 NA），与常使用的荧光显微镜和激光扫描共聚焦显微镜不同，OMX SR 配有18 种不同折射率的镜油。调整镜油的实验步骤是，首先在3DConventional拍摄模式下采集一张图像。接着，根据Orthogonal的分析结果调整镜油。当使用最佳折射率的镜油时，会得到上下均匀的光分布图（见图1）。调整镜油是SIM 拍摄的难点，也是教学的重点与难点。在教学过程中，尽量使用典型样品，比如荧光小球等，让学生记忆标准的光分布结果，在技能训练过程中需要反复练习。

图1 Orthogonal分析中光的对称分布

（4）基本技能训练。在教学中，实验技能训练采用先演示操作，再让学生轮流上机操作的形式。以细胞样品实验教学为例，实验中使用的细胞样品用DAPI标记细胞核，Alexa Fluor 488 标记微管蛋白，DAPI 和Alexa Fluor 488 的激发光分别为405 nm和488 nm。

演示操作按以下步骤进行：① 选择3DConventional模式，405 nm和488 nm两个荧光通道，荧光灰度值控制在8 000 左右，样品拍摄厚度为3 μm，每隔0.125 μm采集一张图像。对得到的拍摄数据进行校色和三维最大投影，然后导出3D-Conventional 三维投影的结果。② 对3D-Conventional 的原始数据依次进行Deconvolution 算法处理、校色、三维最大投影，导出Deconvolution 三维投影的结果。③ 选择3D-SIM拍摄模式，405 nm和488 nm两个光通道，荧光灰度值同样控制在8 000 左右，样品拍摄厚度为3 μm，每隔0.125 μm采集一张图像。对拍摄数据依次进行三维重构、图像校色、三维投影，导出3D-SIM 的三维投影结果。④ 比较分析宽场图像、Deconvolution 图像和SIM图像之间的差别，让学生体会不同拍摄模式得到图像分辨率的差别。比如，图2 所示的结果显示Conventional、Deconvolution 和SIM 均观测到细胞核和微管的结构。通过比较发现SIM 图像中细胞核和微管结构的细节最清楚，图像分辨率和质量最高，其次是Deconvolution 的图像。Conventional 的图像有明显光晕。

图2 微管和细胞核的三维投影显微图像

在演示教学之后，让学生轮流进行操作练习。大型仪器操作步骤多，学生需要反复练习才能熟练掌握。练习过程中老师全程陪同，对拍摄中的问题进行及时指导教学，直到学生能完成完整的实验操作，采集到满意的图像。

（5）开放性实验。为了充分调动学生学习的主动性和积极性，同时增加教学内容的丰富性和灵活性，教学设计中加入了开放性实验内容。实验教学面向研究生开展，在实验课前1 周通知学生自主设计实验、准备样品。在掌握基本实验技能的基础上，让学生根据自己的样品选择合适的拍摄模式，独立设计拍摄方案，并独立操作仪器。常见的拍摄样品类型包括细胞样品、组织切片和高分子材料等，OMX SR 配备的4 个激光光源能满足学生使用的荧光染料或标记物的激发光要求。在实验教学过程中，如果遇到问题，遵循先引导学生分析原因，再指导其制定解决方案的原则。最后将总结归纳的内容及时反馈给学生，帮助学生改进实验方案。

（6）课程考核。考核与评价是实验教学中的重要组成部分，是检验教学质量、教授与学习效果的有效手段。为了全面科学地评价学生的实践能力和综合素质，本教学方案将多元化设计实验课程考核的内容。考核内容包括课堂出勤、实验技能测试、自主实验设计和实验报告撰写。实验课的目的不只是掌握仪器的使用操作，更重要的是提高提出问题、分析问题、解决问题的能力。因此，实验报告除了记录实验内容、操作步骤和数据之外，还增加了数据分析和讨论两部分内容。

3 讨 论

荧光显微镜是生命科学研究中的重要工具，具有直观性、特异性和可观测活细胞等特点。然而，荧光显微镜分辨率的提高受到光衍射极限的限制。与传统荧光显微镜相比，激光扫描共聚焦显微镜的分辨率有了较大的提升，该显微镜利用共轭针孔技术减少了非焦平面的信息。依赖激发波长，激光扫描共聚焦显微镜的分辨率可达x y轴230 nm，z轴500 nm［22-24］。但是随着科学研究的深入，激光扫描共聚焦显微镜的分辨率已不能满足科学家们对细胞内精细结构等研究的要求。到20 世纪末，科学家们相继提出了突破衍射极限的光学显微成像方法，超高分辨显微镜的概念被提出来，这给显微镜和科学研究的发展带来了突破性的进展。实验教学中加入超高分辨显微镜中结构光照明显微镜的内容是紧跟科研发展的选择，这样不仅使教学可以更好地服务于科研工作，还可以帮助学生拓宽知识面、提升综合实验能力。

大型精密仪器具有操作复杂，维护成本高等特点，这使其实验教学多局限于演示教学。在超高分辨显微镜的实验教学设计上采用小组教学的形式，教师全程指导、严格要求、规范操作，给每个学生提供上机操作的机会。教学设计上由浅入深，重视对仪器原理的讲解，掌握扎实的理论基础有助于学习实验技术。通过设置开放性试验，培养学生动手操作与独立思考的能力。开放实验样品类型多样，在图像采集、参数设置等过程能够进行有针对性的分析教学，这样增加了课程的灵活性、趣味性和实用性。在教学中注重经验总结和反馈教学。比如在实验过程中发现学生制备的样品存在统一的问题，盖片上有多余封片剂等污染物，盖片位置靠近载玻片边缘从而影响观察等。教学中应把学生在样品制备和实验操作中常见的错误进行总结归纳，并在课程中作为重点进行讲解。此外，小组教学给师生间提供了更多的交流机会，学生思维活跃，在课堂中会提出新想法或问题，这对教师的综合实验能力和知识面提出了更高的要求，直接促进了教师的自主学习和提升。

4 结 语

在“双一流”建设的目标下，着力建设了显微成像仪器的共享平台，并尽力做到科研教学并重。超高分辨结构光照明显微镜在生命科学领域有着重要的作用，该显微镜已被广泛用于细胞内精细结构、蛋白精确定位和活细胞动态观测等研究中。在实验课程中加入大型精密仪器的理论和实践教学具有很强的实用性，同时对于培养学生的综合实验能力和创新性思维也有着积极的促进作用。