加速溶剂萃取法结合超高效液相色谱-荧光法测定禽蛋中甲砜霉素残留

刁志祥，王 波，赵 霞，谢恺舟*

（1.扬州大学动物科学与技术学院，江苏扬州 225009；2.教育部农业与农产品安全国际合作联合实验室，江苏扬州 225009；3.扬州大学兽医学院，江苏扬州 225009）

甲砜霉素（Thiamphenicol，TAP）是一种酰胺醇类的广谱抗生素，对革兰氏阳性菌和阴性菌均有抑制作用，常用于畜禽疾病治疗[1-2]。然而，TAP 可抑制机体红细胞、白细胞和血小板生成，同时具有较强的免疫抑制作用。如果长期食用含有TAP 药物的禽蛋，人类会产生胃肠道反应、腹泻、恶心和呕吐等症状，严重者可导致死亡。因此，中国农业农村部、美国食品药品监督管理局和欧盟都设定了动物源性食品中TAP 最大残留限量为50 μg/kg[3-5]。

目前，关于动物源性食品中TAP 残留的样品前处理方法主要有液-液萃取法（LLE）[6-8]、固相萃取法（SPE）[9]、LLE-SPE 法[10]、LLE-薄层色谱纯化法（TLC）[11]，可转换亲水性分散溶剂型液-液微萃取（SHDS-LLME）[12]、织物相吸附萃取法（FPSE）[13]、基质固相分散萃取法（MSPD）[14]、亚临界水萃取法（SWE）[15]及QuEChERS 法[16]。其中，LLE 方法提取样品基质操作简单，但消耗试剂多、耗时长、不适合用于样品的批量处理。SPE 工艺需使用昂贵的Oasis MCX SPE 柱，且提取、洗脱时间长。LLETLC 方法操作复杂，净化程序繁琐，针对样品基质提取单一（主要用于饲料样品的提取、净化），而有关加速溶剂萃取法（Accelerated Solvent Extraction，ASE）提取禽蛋中的TAP 未见报道。ASE 法将高温和高压与液态溶剂相结合，通过少量溶剂即可从固体和半固体样品中迅速萃取化合物，全自动且节约时间和溶剂[17]。本试验采用ASE 样品前处理方法，用乙腈饱和的正己烷去脂，乙腈:氨水（98:2，V/V）作为提取剂，建立禽蛋中TAP 残留的UPLC-FLD 法，为禽蛋中TAP 残留检测提供新的，可靠的检测方法和技术手段。

1 材料与方法

1.1 试验动物 本研究分别选取28 周龄产蛋京海黄鸡30只（江苏京海禽业集团有限公司）、28～30 周龄产蛋高邮鸭30 只（江苏高邮鸭集团）、30 周龄产蛋扬州鹅48只（扬州天歌鹅业发展有限公司），试验前预试1 周，试验期间均饲喂不添加任何药物的全价饲料，连续10 d每天收集禽蛋匀浆后分装，样品保存在-34℃低温蛋库中。

1.2 主要试剂及仪器 TAP 标准品（纯度≥99.0%）（德国Dr.Ehrenstorfer GmbH 有限公司）；乙腈（色谱纯）（EMD Millipore 公司）；三乙胺（纯度≥99.0%，色谱纯）（赛默飞世尔科技（中国）有限公司）；磷酸二氢钠（NaH2PO4，纯度≥99.0%）、十二烷基硫酸钠（纯度≥95.0%，分析纯）（北京索莱宝科技有限公司）。

Acquity UPLC 型超高效液相色谱仪、Acquity FLD荧光检测器（Waters 公司）；ASE350 型加速溶剂萃取仪、Smart2-Pure 型智能一体化超纯水系统（Thermo Fisher公司）；ScanSpeedVac40 型离心浓缩仪（LaboGene 公司）。

1.3 标准溶液的配制 标准储备溶液：准确称取TAP 标准品4.04 mg（实际含TAP为4.00 mg），用乙腈定容于10 mL 棕色容量瓶中，制成400 μg/mL 的对照品储备液，分装、密封，置4℃冷藏保存。

1.4 试验方法

1.4.1 样品的提取 本试验采用LLE 和ASE 2 种样品前处理方法分别对禽蛋样品进行提取、净化。

LLE 方法：称取2.0 g（精确至0.01 g）均质的禽蛋样品于50 mL 聚丙烯离心管中，先后分别加入1 mL 30%的乙腈溶液、10 mL 乙腈氨水混合液（98:2），涡旋使之充分混合，振荡萃取15 min，4℃条件下8 000 r/min离心10 min，上清液转移至50 mL 聚丙烯离心管中；重复提取1 次，合并上清液待用。

ASE 方法：称取2.0 g（精确至0.01 g）均质的禽蛋样品放于研钵中，加入适量硅藻土研磨均匀。充分研磨后，装入22 mL 萃取池中并填满，设定萃取温度为80℃，萃取压力为1 500 psi，萃取时间为5 min。冲洗溶剂为乙酸乙酯氨水混合液（98:2），用量约为40%的池体积，每个样品之间自动冲洗1 次，氮气吹扫时间60 s，静态循环萃取2 次，萃取液收集于60 mL 收集瓶。

1.4.2 样品的净化 禽蛋样品经LLE 或ASE 处理后，收集萃取液经离心浓缩仪浓缩近干。再加入1 mL 乙腈，涡旋震荡溶解残渣后加入10 mL 乙腈饱和的正己烷除脂，涡旋震荡1 min 后静置5 min，弃去上层正己烷，重复去脂1 次。50℃条件下离心浓缩仪上将萃取液吹干，用2 mL 乙腈水溶液（36:64）复溶溶解残渣，涡旋1 min 后以12 000 r/min 离心15 min，过0.22 μm 聚偏氟乙烯（PVDF）针式滤器，滤液供UPLC-FLD 检测。

1.4.3 液相色谱-荧光条件 色谱柱：Waters ACQUITY UPLC BEH C18柱（2.1 mm×100 mm，1.7 µm）；流 动相A：0.005 mol/L 的NaH2PO4溶液（内含0.003 mol/L十二烷基硫酸钠和0.05%的三乙胺，用85% H3PO4调pH 至5.3±0.1），流动相B：乙腈，等度洗脱：A:B=64:36；流速：0.2 mL/min；柱温30℃；进样量：10 µL。激发波长229.8 nm，发射波长285.3 nm，增益为1，扫描速率为5，时间常数模式为正常模式。

1.4.4 标准曲线的绘制 分别取适量的禽蛋空白样品提取液添加一定浓度的TAP 标准溶液，使对应鸡蛋中TAP 的添 加浓度为9.7、20.0、50.0、100.0、150.0、200.0、250.0 μg/kg，鸭蛋中TAP 的添加浓度为9.9、20.0、50.0、100.0、150.0、200.0、250.0 μg/kg，鹅蛋 中TAP的添加浓度为9.8、20.0、50.0、100.0、150.0、200.0、250.0 μg/kg，并将上述各浓度样品进行UPLC-FLD 检测，绘制标准曲线。

1.4.5 样品回收率测定 准确称取（2.0±0.02）g 匀浆好的空白禽蛋样品，将样品与硅藻土研磨均匀成粉末状后，向其中加入TAP 标准工作液适量，使鸡蛋中TAP 添加浓度为9.7、25、50、100 µg/kg，鸭蛋中TAP 添加浓度为9.9、25、50、100 µg/kg，鹅蛋中TAP 添加浓度为9.8、25、50、100 µg/kg，每组设定6 个平行，再供UPLC-FLD 检测，最后代入标准曲线中求得浓度，并计算样品回收率。

1.4.6 精密度测定 在同一天的不同时间点用同一台仪器和同一条标准曲线对4 个添加浓度分别进行6 次样品测定，求出日内相对标准偏差（Relative Standard Deviation，RSD）。在1 周内的不同天、用不同的标准曲线（每天都绘制标准曲线）、同一台仪器同样方法求出日间RSD。

1.4.7 检测限和定量限测定 用空白基质液逐级降低低浓度的TAP 标准工作溶液，用已有的UPLC-FLD 方法进行分析，每个浓度分析3 次，得出信噪比（S/N）平均值，得出方法对应检测限（Limit of Detection，LOD）和定量限（Limit of Quantitation，LOQ）。

2 结果

2.1 色谱图 以鸡蛋为例，图1为TAP 标准品、空白鸡蛋、鸡蛋加标色谱图。在超高效液相色谱条件下，TAP 与干扰杂质实现较好的分离，峰形对称且保留时间在1.50 min 左右，与标准品色谱图目标化合物的保留时间接近。

2.2 激发和发射波长谱图 将25 μg/kg TAP 加标禽蛋样品基质液通过荧光扫描，进一步优化目标物质的检测波长，确定在本试验条件下的目标物质的最佳检测波长。最终选择激发波长为229.8 nm，发射波长为285.3 nm。在此波长下既保证了目标物的高响应值，又保证无杂质的干扰（图2）。

2.3 专属性 标准工作溶液的色谱图见图1-A，空白鸡蛋的色谱图见图1-B，鸡蛋中阳性添加（添加量为25 μg/kg）色谱图见图1-C。如图1 可知，空白鸡蛋中不含干扰测定的物质；阳性添加样品中，目标物保留时间在1.5 min左右，且峰形良好。

2.4 标准曲线、检测限和定量限 配制一系列甲砜霉素的标准工作液浓度，添加到上述样品前处理方法处理好的空白禽蛋中，最终在空白禽蛋中TAP 的添加浓度为LOQ、20.0、50.0、100.0、150.0、200.0、250.0 μg/kg，依次进行UPLC-FLD 测定。以试样加药浓度为横坐标，峰面积为纵坐标，绘制标准曲线，按照1.4 中建立的方法进行添加实验，按照信噪比（S/N）为3 确定LOD，按S/N为10 确定LOQ，结果见表1。

2.5 精密度与回收试验 分别称量空白鸡蛋、鸭蛋和鹅蛋样品，进行甲砜霉素的1 倍LOQ、0.5 倍最高残留限量（Maximum Residue Limit，MRL）、1 倍MRL 和2倍MRL 这4 个浓度的加标回收实验，并且每个浓度水平进行6 次平行实验，分别考察3 d，根据检测结果计算回收率，并用RSD 评价日内、日间精密度，LLE 和ASE 2 种样品前处理方法测定的结果见表2 和表3。

2.6 稳定性试验 本研究测定了甲砜霉素标准溶液在-75℃下放置5 个月，每月测定1 次；4℃下放置1、5、10、15、20、25、30 d；25℃（室温）下放1、5、10、15、20、25 h，进行稳定性考察。结果表明，在-75℃下，可以稳定保存5 个月；4℃下，可以稳定保存1 个月；在25℃（室温）下可稳定保存20 h。

2.7 实际样品分析 本研究建立的测定禽蛋中TAP 的加速溶剂萃取-超高效液相色谱-荧光法可成功应用于实际样品分析中。对扬州附近农贸市场中的鸡蛋、鸭蛋和鹅蛋各40 个进行抽样测试，尚未检出TAP 残留。同时，在母鸡产蛋期间，饲喂含有50 μg/kg TAP 的饲料2 周后收集1 周的鸡蛋。按照本试验中1.1 和1.4 的方法进行样品收集和前处理，再经UPLC-FLD 进行检测分析，成功检测出质量浓度为15～32 μg/kg。

3 讨 论

3.1 色谱条件的优化 本研究中流动相体系采用乙腈-0.005 mol/L 的NaH2PO4溶 液（内 含0.003 mol/L十二烷基硫酸钠和0.05% 的三乙胺，用85% H3PO4调pH 至5.3±0.1，乙腈黏度较小，可以有效降低色谱体系压力。流动相中加入三乙胺可以消除色谱柱填料表面硅羟基作用，同时将流动相的pH 调至5.3±0.1 以抑制解离，改变TAP 的峰形，减少峰拖尾现象[6]。通过调节流动相的比例改变流动相极性和离子强度，从而使目标物与杂质很好地分离。当乙腈比例从20%调节到50%时，目标物的出峰时间缩短；当乙腈比例为40% 时，目标物与杂质峰重叠，无法检测；当乙腈比例为36% 时，目标物与杂质峰完全分离，峰形尖锐，可用于检测禽蛋中TAP 残留。在优化好的荧光检测和流动相、等度洗脱程序条件下，TAP 能够很好地在鸡蛋、鸭蛋、鹅蛋中分离，检测时间短，且峰形好。

表1 禽蛋中甲砜霉素基质标准曲线、定量限和检测限

表2 禽蛋中甲砜霉素检测的回收率和精密度（LLE）（n=6）

表3 禽蛋中甲砜霉素检测的回收率和精密度（ASE）（n=6）

3.2 提取条件的优化 乙酸乙酯:乙腈:氨水（49:49:2）[6-7]、乙酸乙酯:氨水（98:2）[8,15]和乙腈:氨水（98:2）作为样品前处理方法常用的提取剂，不仅可以从禽蛋样品中提取TAP，还可以对禽蛋产生沉淀蛋白作用。通过比较试验发现，上述3 种提取剂均能萃取出目标物，而乙腈的去蛋白效果更好，禽蛋中最主要的干扰物质就是蛋白质，为了获得更好的检测效果，最终选择乙腈∶氨水（98:2）作为提取剂。本研究采用LLE 和ASE 2 种方法对禽蛋样品进行处理，方法回收率均能满足欧盟方法要求。在先前研究的基础上[6-7]，LLE 方法进行重新选择了乙腈:氨水（98:2）作为提取剂。本研究重点优化了ASE 方法的各项参数。ASE 的压力条件一般在10.3 MPa左右，改变压力对目标物的回收率影响很小[18]。本试验研究了不同提取温度（40、60、80、100、120℃）对目标物提取回收率的影响，结果表明，80℃为最佳的提取温度，在此温度下目标物的响应值最高，萃取效果最佳。同时，研究还比较了不同的静态萃取时间（2、3、5、8 min）和萃取次数（1 次和2 次）对目标物提取回收率的影响，结果表明，5 min为最佳静态萃取时间，萃取回收率最高；萃取2 次比1 次更加彻底，目标物的回收率更高。萃取剂的体积为40% 的池体积时，目标物可以充分萃取出来，因此没必要再增加萃取剂的用量。综上所述，最终确定ASE 的提取条件：80℃，10.3 MPa，40%的池体积，静态萃取5 min，静态萃取2 次。

3.3 与已有方法的比较 禽蛋样品经过LLE 方法前处理后，在1 LOQ、0.5 MRL、1 MRL 和2 MRL 4 个浓度水平，禽蛋中甲砜霉素的回收率均在82.9%～94.5%，日内RSD、日间RSD 均小于5.9%；禽蛋样品经过ASE 方法前处理后，在LOQ、0.5 MRL、1 MRL 和2 MRL 4个浓度，禽蛋中甲砜霉素的回收率均在85.6%～95.3%，日内RSD、日间RSD 均小于5.4%。与LLE 方法相比，ASE 方法样品回收率和精密度高一些，同时ASE方法自动化、耗时短和消耗试剂少，有利于批量处理样品。另外，本研究样品出峰时间1.5 min 较谢恺舟等[6]研究的4.28 min 早了许多，有利于节约检测时间，提高检测效率且减少溶剂的浪费。本研究加标回收率为82.9%～95.3%，相对标准偏差在4.0% 以内，检测效果较前人研究均有较大提升，证明了本研究方法的优越性。

3.4 基质效应的评价 在实际样品分析中，基质效应不可避免，只能通过多种方法降低，例如优化前处理方法、优化色谱条件、稀释进样浓度、减少进样体积等。本研究优化了提取条件及色谱条件，并采用空白基质添加的方法尽可能降低基质效应对试验结果准确度的影响。

4 结 论

本研究对ASE 样品前处理方法的萃取溶剂、萃取温度、萃取时间及次数等多方面进行了系统优化，并结合超高效液相色谱-荧光法进行了禽蛋中甲砜霉素残留检测分析；同时与传统的液-液萃取方法进行了比较，该方法不仅具有消耗试剂少、耗时短以及适合批量处理样品等优势，而且操作简单、自动化、回收率和精密度高、准确可靠，适用于禽蛋中甲砜霉素的快速筛查、定性筛选和定量测定。