DNA 甲基化影响不同猪种胚胎期肌肉发育差异的研究进展

李秀金，王金辉，黄运茂，张续勐*

（1.仲恺农业工程学院动物科技学院，广东广州 510225；2.广东省水禽健康养殖重点实验室，广东广州 510225）

中国是世界最早饲养猪的国家之一，复杂辽阔的国土和多年的选育使我国具有丰富的地方猪种资源。中国地方猪种除了适应当地气候环境外，也兼具优良的肉质性状，但普遍存在产肉量较低、生长较慢等问题。《中国畜禽遗传资源志》（猪志）的数据显示，西方瘦肉型猪瘦肉率在60% 以上，而中国地方猪的瘦肉率则大多在40% 左右。多年来，不同猪种肌肉发育的差异调控机制一直是动物遗传领域的研究热点。

除基因表达调控外，表观修饰也是决定动物性状的重要调控机制。表观修饰是指在细胞核DNA 中核苷酸序列没有改变的情况下，基因功能可逆、可遗传的改变，这些改变包括DNA 修饰（如DNA 甲基化修饰）、组蛋白修饰（如组蛋白甲基化、乙酰化）和RNA 干扰等[1]。哺乳动物在胚胎期组织发育发生剧烈变化的同时也伴随着剧烈的表观修饰变化，而这些表观修饰的变化和关键基因的表达相互调控，对胚胎的正常发育和出生后的性状具有重要作用[2]。本文结合研究团队近年来的研究，介绍了DNA 甲基化对哺乳动物胚胎期肌肉发育的影响及不同猪种骨骼肌DNA 甲基化的研究进展，并对利用表观遗传手段提高中国地方猪种产肉量的方法进行展望。

1 猪骨骼肌发育的基本过程

猪胚胎期骨骼肌有2 轮发育过程：①初级肌纤维的形成阶段：猪妊娠后第14～22 天经历体节-轴旁中胚层-生肌节的发育过程，初级肌纤维在妊娠后第35 天左右开始形成，并在妊娠第49 天左右达到增殖顶峰，这一过程一直持续到妊娠第60 天。②次级肌纤维形成阶段：大约在猪妊娠第45～90 天，次级肌纤维围绕初级肌纤维形成并分化发育，这个过程在妊娠第75 天左右达到顶峰，妊娠第91 天后肌纤维数目几乎不再改变[3-5]。这一现象同样出现在牛、鸡等动物中，即肌纤维总数在胚胎期或孵化时（鸡）就已经确定（图1）[6]。肌纤维在出生后主要进行成熟过程，该过程主要涉及到肌纤维肥大及类型的变化[7]。因此，猪胚胎期骨骼肌的2 轮发育直接决定了肌纤维形成总数，进而对出生后产肉性状尤其是瘦肉量起着决定性作用。

2 DNA 甲基化对胚胎早期骨骼肌发育的影响

在英国科学家沃丁顿提出的表观遗传模型中，将细胞的命运决定过程比喻成一个球体从山顶向下滑落的过程，山体不同地形决定了球体的走向，而这个地形就是表观修饰。球体从山顶到山下，从多能性到特异细胞类型，经历了多重表观修饰以及基因表达的相互调控所触发的时间、空间的精密调控过程，确保胚胎在合适的时间和地点，形成正确的特异性分化的细胞群体，进而形成不同组织（图2）[8]。

在脊椎动物中，DNA 甲基化主要出现在CpG 二分体的C 位点，它受到DNA 甲基转移酶（DNMTs）家族的催化。在这个家族当中，DNMT1 主要的功能是在复制过程中保持DNA 甲基化状态。而与此相反，DNMT3A 和DNMT2B 则是从头甲基化酶，用来进行基因组甲基化特征的构建。这3 个酶都是发育过程中重要的调控因子，它们中任何一个缺失都会导致小鼠胚胎致死或者出生后不久死亡[9]。近年来，一些激活DNA 去甲基化过程的机制也被报道，包括移除甲基化的碱基或者通过DNA 修复后的脱氨基或者氧化作用。TET 家族是指能够酶催化甲基化的C（mC）氧化成羟甲基化的C（hmC），最后变成甲酰化和羧基化的C 的蛋白家族，进一步支持了DNA 去甲基化过程中DNA 修复的作用[10]。

DNA 甲基化的重编程在人和小鼠的胚胎发育过程中均有报道[11]。受精后，大多数DNA 甲基化印迹被擦除，而着床后DNA 甲基化会迅速上升[12]。着床后获得甲基化的基因主要参与了胚胎早期发育的生物学过程，而着床后失去甲基化的基因则主要参与了组织特异分化的生物学过程中（图3）[2]。前期对猪原始生殖细胞的DNA甲基化研究中发现，与人、小鼠类似，猪原始生殖细胞的DNA 甲基化水平也出现了显著变化：在妊娠15 d 着床前后，出现了剧烈的DNA 甲基化下降的现象，在妊娠20 d 达到最低点，此后开始上升[13]。

增强子能增加其连锁基因的转录频率，也是重要的表观修饰形式之一。有研究显示，MyoD启动子上游20 kb 的核心增强子对MyoD在小鼠胚胎合适的时空表达起到了关键作用[14]。在小鼠胚胎中敲除这段增强子将会导致MyoD的表达晚1～2 d，进而引起成肌进程延迟1～2 d[15]。在小鼠胚胎和成肌细胞系中，MyoD的核心增强子是几乎完全去甲基化的，而在非肌肉细胞系和非肌肉组织中，增强子的甲基化程度则处于较高的状态（图4）[16]。

3 不同猪种骨骼肌发育的DNA 甲基化

目前已有多种检测分析基因组层面DNA 甲基化的测序方法，例如全基因组甲基化测序（WGBS）、还原亚硫酸氢盐测序（RRBS）[17-18]、甲基化DNA 免疫沉淀测序（MeDIP-seq）[19]、甲基结合域测序（MBD-seq，MethylCap-seq）[20-21]和BeadChip array[22]等。然而，RRBS 在MspI 酶切和片段大小选择的过程中减少可研究的基因组比例，其在组织样品中的分析效率较低，并且需要较深的测序深度[23]。MeDIP-seq 则受限于需要基于前人的研究来设计探针，并且不能扫描甲基化程度较低的区域和重复区域[24]。将DNA 通过重亚硫酸盐转换后再进行高通量测序可使DNA 甲基化的检测精确到单碱基水平，该方法近年来已成为甲基化研究的最佳方法之一。总的来说，利用WGBS 法研究DNA 甲基化最准确、分辨率最高。

最近几年，已有科学家利用不同方法对不同品种猪不同组织的甲基化情况进行了研究。Li 等[25]利用MeDIP-seq 法研究了3 个品种猪不同部位的脂肪和骨骼肌，发现品种间、性别间和解剖学位置间存在DNA甲基化的相似性和特异性，并且鉴定了差异甲基化区域。使用荧光标记甲基化敏感扩增基因多态性方法（F-MSAP）对成年猪肌肉、心脏、肝脏、肾、肺和胃DNA 甲基化进行的研究发现，不同组织间DNA 甲基化的变化与组织发育过程中特定基因的表达有关[26]。在利用MeDIP-seq 法对瘦肉型、脂肪型、小型猪DNA 甲基化和转录组进行联合分析的研究中，Wu 等[27]研究发现DNA 甲基化可能通过调控骨骼肌中基因的表达影响猪肥胖和体型大小的趋势。导致产肉量不同的猪种胚胎早期肌肉发育差异的调控机制目前依然不明晰。由于胚胎着床后的早期胚胎发育时期对于组织分化过程十分关键，且经历了剧烈的DNA 甲基化变化，因此关注于这一时期的DNA 甲基化研究有望揭示导致产肉量不同的猪种肌肉发育和基因表达模式差异的原因。

作者所在团队通过对五指山和长白猪的DNA 甲基化和转录组数据的整合分析证实了DNA 去甲基化酶Tet1在分离的猪胚胎成肌细胞和C2C12 细胞中通过Myogenin启动子去甲基化，上调Myogenin表达，从而促进成肌细胞的分化。该研究揭示了产肉量差异猪种的胚胎期肌肉发育的调控机制：因为五指山猪成肌基因较长白猪早去甲基化（胚胎18～21 d，五指山猪成肌基因甲基化程度从70%下降到42%，长白猪成肌基因甲基化从70% 下降到56%），成肌基因早表达导致成肌细胞较长白猪早进入分化过程。由于成肌细胞没有足够时间进行增殖，导致胚胎期初级肌纤维和肌纤维总数较少，因此五指山猪出生后的产肉量也较少（图5）[28-30]。

4 对于不同猪种胚胎期骨骼肌WGBS 研究的思考

作者所在团队对于不同猪种胚胎期肌肉发育的WGBS 研究有2 个新的发现：一个是在所研究的胚胎18、21、28 d，长白猪基因总体的DNA 甲基化水平均高于五指山猪（在胚胎期18～28 d，长白猪DNA 甲基化范围为72%～77%，五指山猪DNA 甲基化范围为69%～73.5%）[28]。前人在猪与小鼠、二花脸与大白猪的DNA 甲基化比较研究中，发现物种、品种特异的DNA甲基化模式[31-32]。 因此，推测存在这一现象的原因是长白猪具有品种特异性甲基化模式。另一个发现是长白猪和五指山猪2 个猪种中DNA 甲基化水平并不总和基因表达相一致。DNA 甲基化已经被证实在很多物种和细胞类型中影响基因表达[33-34]。本团队的研究发现，只有在转录起始位点（±0.2 kb）附近，基因表达和DNA 甲基化呈负相关关系，而在基因区，基因表达和DNA 甲基化则呈正相关关系[28]。这一发现也与之前在人类和牛中的发现一致[35-36]。

在本团队的研究中，五指山猪成肌基因DNA 甲基化降低并且上调表达的进程较长白猪早[28]，其中包含了重要的成肌细胞分化条件因子Myogenin，成肌细胞分化标志基因Myh1以及决定成肌命运分化的H3f3a[37]，而后者也是作者所在团队的蛋白组学研究中五指山与长白猪胚胎骨骼肌表达差异最大的蛋白[38]。哺乳动物的发育伴随着特异的从头开始的甲基化或去甲基化事件，这些事件被认为有利于细胞分化进程[39]。之前的研究也发现，在胚胎发育阶段，保持干性的基因获得甲基化，而组织分化特异的基因逐渐失去甲基化[2]。因此，本团队研究进一步证实了成肌基因转录起始位点附近较早的DNA 去甲基化，以及成肌基因基因区较早较高的甲基化可能会触发五指山猪成肌基因早于长白猪表达，导致成肌分化进程较早开启，这也与本团队研究发现的五指山猪出现肌纤维分化较早的现象相符[38]。

除了骨骼肌，其他的组织器官在小型猪中均小于长白猪，它们的发育差异可能具有相似的调控机制，尤其是在DNA 甲基化层面。然而作为肉用型动物，关于不同品种猪之间差异的研究主要涉及肌肉的主要性状差异[30,35,40]，其他组织则鲜见报道。两品种猪的总妊娠期都是114 d 左右，然而五指山猪却较早出现初级肌纤维[38]。差异的基因表达模式是导致这一现象的最重要原因，加之DNA 甲基化在细胞命运决定和胚胎期基因表达起始过程中发挥关键作用[41]。因此，本团队的研究通过WGBS 发现五指山猪具有较早的成肌基因去甲基化进程，体外实验也进一步证实了成肌基因较早的去甲基化会导致成肌细胞较早分化[28]。而这个表观遗传介导的胚胎肌肉发育模式是否适用于其他组织的发育仍需进一步研究。

5 猪胚胎期肌肉发育的DNA 甲基化研究展望

猪的肌纤维总数在出生前就已经决定，而无论是中国地方猪种还是西方瘦肉型猪种，它们的胚胎期均为114 d 左右，因此相似胚胎时期内的肌肉发育进程的差异很可能导致了不同猪种出生后产肉量的差异。除了基因表达调控以外，表观遗传学也是决定生物性状重要的调控机制。随着转录组、蛋白组、全基因组甲基化等测序技术的发展，通过在胚胎早期肌肉发育阶段探究不同猪种差异的DNA 甲基化模式，可以溯源并筛选出导致不同猪种胚胎期成肌关键基因差异表达模式背后的原因，例如作者所在团队发现的DNA 去甲基化酶Tet1的差异表达。利用近年来不断发展的基因编辑手段（如CRISPR-Cas9 技术），构建可诱导基因表达的基因编辑猪品系（如Cre-loxP基因敲入猪），在怀孕母猪胚胎期控制候选基因（如Tet1）的表达时间，从而改变胚胎早期DNA 甲基化修饰模式和成肌关键基因的表达时间，将为提高中国地方猪种产肉量提供新的方向。