下颌扩弓对龈沟液中骨硬化蛋白浓度的影响

韩易辰 赵桂芝 赵冰净 肖依寒 申 涛 柯 杰

正畸牙齿移动(Orthodontic Teeth Movement，OMT)是在力的作用下牙周支持组织改建进行的，多种蛋白(细胞因子、趋化因子、生长因子、细胞外基质蛋白等)参与其中，通过特定蛋白的含量变化可以帮助了解牙周组织对力的反应。骨硬化蛋白(Sclerostin)由SOST 基因编码[1]，是由成熟骨细胞特异分泌的一种糖蛋白，在骨代谢过程中起到重要作用，能够抑制由成骨细胞介导的骨形成[2]。目前慢性牙周炎及种植体周围龈沟液中骨硬化蛋白的含量受到越来越多的关注[3-5]，但正畸治疗过程中，龈沟液中骨硬化蛋白含量变化鲜有研究，本实验拟通过检测下颌扩弓牙齿移动过程中龈沟液中骨硬化蛋白浓度变化，初步探究其与骨代谢的关联，以期为监测下颌扩弓骨改建提供一个可行的生化指标，从而提高下颌扩弓的安全性。

1. 资料和方法

1.1 研究对象 选取2019 年1 月至2019 年6月来空军特色医学中心口腔科进行上下颌联合扩弓治疗的患者25 例，男11 例，女14 例，年龄11～14 岁，平均年龄12.4±1.1 岁。纳入标准：(1)上、下颌轻中度拥挤伴有牙弓狭窄；(2)未做过正畸治疗；(3)混合牙列期患者前牙与第一磨牙已萌出；(4)无颅面畸形及综合症；(5)无系统性疾病，牙周组织健康。排除标准：有系统性疾病，骨代谢疾病，口腔卫生较差，依从性差者。

1.2 实验设计 实验准备阶段：拍摄全口曲面断层片及头颅侧位片；分别取上下颌模型，制作上下颌扩弓器；对患者及家长进行口腔卫生宣教；为纳入实验的患者行全口龈上洁治术；患者家长签署知情同意书。

固定矫治阶段：牙周洁治一周后，将制作好的扩弓器带入患者口内，旋转中央螺丝横向打开扩弓器的螺旋扩大结构，每次加力旋转1/ 4 圈横向扩大牙弓0.25mm，对患者采取上颌快速扩弓，每天通常加力两次(0.5mm/ 天)，下颌采用中快速扩弓技术，每天通常加力一次(0.25mm/ 天)，一周复查一次[6];唇侧粘MBT 托槽(3M)，上下颌带入0.016″热激活镍钛圆丝[6];根据患者拥挤度及耐受情况采取上颌扩弓约20 天，下颌扩弓约40 天。扩弓器保持6 个月后，拆除扩弓器。

临床数据采集阶段：带入扩弓器前T0、下颌加力结束时T1、保持3 个月T2、保持6 个月拆除扩弓器后T3四个时间点分别拍摄CBCT，对下颌第一前磨牙和第一磨牙的颊侧进行牙周临床指标检查(牙周探诊深度PD、牙龈退缩水平GR、临床附着丧失CAL、菌斑指数PLI、牙龈指数GI)以及龈沟液采集。

1.3 实验方法

1.3.1 龈沟液的采集 分别选取下颌双侧第一前磨牙、第一磨牙的颊侧采集龈沟液，先用水流轻柔的冲洗受试牙，并使用棉卷隔离，持无油压缩气枪沿牙面轻吹，保持静置1 分钟。然后将whatman 滤纸条(2mm×10mm，每个EP 管中1 条，共同用精确电子天平称重并记录)插入龈沟内1mm，保持30s 后取出，将滤纸条放入原保存的EP 管内，精确电子天平再次称重，取前后重量差值即采集龈沟液的质量；观察滤纸条有无血液污染，若沾及血液即废弃，10min 后重新收集；按照1mg/ μl的龈沟液比重计算龈沟液体积并记录后，即刻加入100μl PBS 缓冲液，置- 80℃冰箱中保存备用。所有样本均由同一名实验者采集。

1.3.2 龈沟液中骨硬化蛋白含量的测定 采用ELISA 法(海联生物人骨硬化蛋白试剂盒)检测龈沟液中骨硬化蛋白含量，严格按照试剂盒说明书进行操作，双侧同一牙位取平均值:

a. 将人骨硬化蛋白试剂盒从冰箱中取出，平衡30 分钟，使①20×洗涤缓冲液②检测抗体- HRP③96 孔微孔酶标板④样本稀释液⑤底物A⑥底物B⑦终止液⑧标准品(6 管)恢复至室温(18- 25℃)；

b. 按1 份洗涤缓冲液加19 份蒸馏水的配比(1∶20)稀释20×洗涤缓冲液；

c. 分别设标准品孔、空白孔、待测样本孔：标准品孔加标准品(分别加入不同浓度的标准品50μl)、空白孔加样本稀释液50μl、待测样本孔加待测样本各50μl，轻轻震荡混匀；

d. 标准品孔、空白孔、待测样本孔中每孔加入辣根过氧化物酶标(HRP)标记的检测抗体100μl，覆上封板膜封住反应孔，37℃水浴锅恒温温育1 小时；

e. 弃去酶标板孔内液体，并在吸水纸上拍干，每孔加满洗涤液(350μl)，静置1 分钟，甩去洗涤液，吸水纸上拍干。按照以上步骤，重复洗板5 次；

f. 每孔分别加入底物A、底物B 各50μl，37℃避光恒温孵育15 分钟；

g. 每孔加入终止液50μl，在反应终止后15分钟内用酶标仪在450nm 波长依序测量各孔的光密度(OD 值)。

h. 根据标准品的浓度及OD 值计算出样本浓度- OD 值曲线，代入各孔的OD 值，计算出各孔样本的浓度；各孔样本的浓度*样本体积/ 龈沟液体积即得到相应龈沟液中骨硬化蛋白浓度，左右同名牙结果取平均值。

1.3.3 临床牙周指标检查 牙周探诊深度(Probing Depth，PD): 用Williams 刻度探针沿牙长轴方向插入牙龈沟底，记录颊、舌侧，近中、远中位置的牙龈缘至龈沟底的距离，取最大值作为PD 值。

牙龈退缩水平(Gingival Recession，GR): 用Williams 刻度探针沿牙长轴方向插入龈沟探及釉牙骨质界，记录颊、舌侧，近中、远中位置的牙龈缘至釉牙骨质界的距离，取最大值作为GR 值。

临床附着丧失(Clinical Attachment Loss，CAL)：当龈缘位于CEJ 根方时，CAL=PD+GR；当龈缘位于CEJ 冠方时，CAL=PD- GR；当龈缘平齐CEJ 时，PD=GR，CAL=0 值。

菌斑指数(Plaque Index，PLI): 根据菌斑的量和厚度来计分，计分标准: 0= 无菌斑; 1= 牙面可见薄层菌斑，视诊不可见，但探针尖侧面可刮出菌斑; 2= 可见中量菌斑; 3= 可见大量软垢。

牙龈指数(Gingival Index，GI)：0= 牙龈健康；1= 牙龈轻度炎症：牙龈的颜色有轻度改变并轻度水肿，探诊不出血；2= 牙龈中等炎症：牙龈色红，水肿光亮，探诊出血；3= 牙龈严重炎症：牙龈明显红肿或有溃疡，并有自动出血倾向。

1.3.4 影像学检查 患者的全部CBCT 数据均由口腔科同一名放射科医生使用同一台设备进行采集，将采集的影像学资料导入到Invivo 5 软件中，调整头位：使患者在矢状向上颌面部中线与基准水平线垂直，在冠状向上在咬合平面与基准水平线平行，水平向上双侧颌骨及牙列基本对称。之后在水平轴的视图下，选中刚好通过右侧下颌第一磨牙根分叉的水平面，进行颊侧牙槽骨厚度的测量。

牙齿颊侧牙槽骨厚度BB[29]：下颌第一前磨牙取牙根颊侧最外侧点到颊侧皮质骨外侧面的距离，下颌第一磨牙取近远中根颊侧最外侧点连线的中点到颊侧皮质骨外侧面的距离，双侧同名牙测得数据取平均值，分别记作BB 4，BB 6。所有实验数据均由同一人重复三次(每次间隔一周)完成，测量结果取其平均值。

1.4 统计学分析 采用SPSS 18. 0 统计软件进行数据分析，计量资料以x±s 表示，治疗前后比较采用配对t 检验，以P≤0. 05 为差异有统计学意义。

2. 实验结果

结果表明，同名牙(第一前磨牙与第一磨牙)龈沟液体积T0～T3没有明显差异，但是相同时间点第一磨牙采集到的龈沟液体积多于第一前磨牙，且具有统计学意义；同名牙龈沟液骨硬化蛋白GCF Scl浓度T0～T1显著升高，T1～T2显著下降，T2～T3显著下降，但T3较T0没有明显差异，且GCF Scl浓度在T0和T3阶段第一前磨牙与第一磨牙之间未见明显差异(表1，2)；

牙周探诊深度PD、牙龈退缩水平GR、临床附着丧失CAL T0～T3之间的变化并无统计学差异；牙龈指数GI、菌斑指数PLI T1较T0都有显著升高，但T1～T3之间的变化并无统计学差异，实验过程中未见明显的探诊出血(表3)；

同名牙颊侧牙槽骨厚度BB T0～T1显著下降，T1～T2未见明显差异，T2～T3略有上升，有统计学意义，但T3较T0仍有显著下降(表4)；T0～T3相同时间点第一前磨牙颊侧牙槽骨厚度BB 4 与第一前磨牙颊侧牙槽骨厚度BB 6 未见显著差异。

表1 检验指标—第一前磨牙

表2 检验指标—第一磨牙

表3 牙周临床指标

表4 影像学指标.颊侧牙槽骨厚度

3. 讨论

龈沟液是一种血浆衍生渗出物[7]，分析龈沟液中特定成分的含量能够为评估局部细胞代谢提供指导[8]，骨硬化蛋白作为骨形成抑制剂参与牙槽骨的吸收与改建[9]，在人及大鼠的成牙骨质细胞、成牙本质细胞、牙周组织和牙槽骨骨细胞中均有表达[10-12]，并存在于在龈沟液中[3,9]。以往的研究主要集中在牙周组织炎性对GCF Scl 浓度的影响，但在正畸治疗中机械力对其影响则鲜有研究。下颌扩弓主要依靠机械力使牙齿颊向移动，排除了腭中缝效应对骨硬化蛋白含量的影响，所以本研究选取患者的下颌龈沟液作为研究对象，研究下颌扩弓对GCF Scl浓度的影响，探究其作为检测下颌扩弓安全性的生化指标的可行性。

本研究测量下颌扩弓开始到保持结束4 个时间点(带入扩弓器前T0、下颌加力结束时T1、保持3个月T2、保持6 个月拆除扩弓器后T3)颊侧GCF Scl 的含量，从结果可知：下颌扩弓机械力的加载可以使GCF Scl 浓度产生变化。以往的研究[4,7,13,14]已经证实慢性牙周炎患者GCF Scl 含量较健康患者显著上升，但是，通过对牙周临床指标的检测，可以发现在佩戴下颌扩弓器后，由于托槽及扩弓器增加了患者牙齿清洁的难度，PLI 和GI 均有明显的上升，但是在治疗过程中，未见明显变化，而且牙周检查过程中也未见到明显的探诊出血及显著探诊深度PD 的变化，T2PD 的增加可能是由于牙齿清洁困难导致牙龈生长的缘故[15]，而并非炎症状态下的附着丧失，以上说明下颌扩弓并未造成牙周的明显炎症，本实验中GCF Scl 的含量变化主要是下颌扩弓过程中机械力的作用。结合GCF Scl 的变化与CBCT 结果，我们可以发现：

(1)T0～T1时，随着机械力的刺激，使牙周组织中骨硬化蛋白表达增加，此时骨形成受抑制，骨吸收作用明显，所以表现为颊侧牙槽骨厚度降低；

(2)T1～T2时，由于扩弓器停止加力，牙周组织中骨硬化蛋白表达逐渐降低，但仍然高于正常水平，此时骨吸收作用仍然显著，但是颊侧牙槽骨厚度并没有显著变化，可能是由于此时骨形成作用也逐渐加强，并与骨吸收作用达到一个平衡。King GJ 等[16]通过动物实验发现力的作用下的压力侧骨改建会首先经历3 到5 天的骨吸收作用，随后经过5 到7 天的逆转期，之后的7 到14 天将以骨形成为主要过程；Rober 等[17]对骨代谢生化指标的综述中也提到在力的作用下骨改建过程，骨吸收的相关指标会在力的刺激后1 到3 个月率先升高，骨形成的相关生化指标会在随后6 到9 个月升高。Giuseppe Perinetti[18]等测量上颌扩弓时颊侧龈沟液中ALP的含量，发现在扩弓结束保持3 个月到6 个月时，其含量显著性的持续升高，ALP 作为骨形成的生物学标记物，其含量的增加可以说明从扩弓结束保持3 个月到6 个月的时间里，骨形成作用在不断加强，并且相同的过程可能也发生在下颌扩弓治疗过程中。所以随着骨吸收作用不断减弱和骨形成作用不断加强，在T1～T2时，二者可能维持一个相对平衡，导致CBCT 数据测量上未见到颊侧牙槽骨厚度的显著变化，但是，此时GCF Scl 表达仍高于初始水平，骨吸收作用应该仍处于活跃状态；

(3)T2～T3时，牙周组织中骨硬化蛋白表达逐渐降低至初始水平，骨吸收作用逐渐恢复到正常状态，这个过程中，骨形成作用仍然显著，进而使得颊侧牙槽骨厚度逐渐增加。但是此时牙槽骨厚度依旧低于初始状态，结合Rober 等人的研究，提示在扩弓加力结束6 个月后，骨形成作用可能仍会持续，所以颊侧牙槽骨厚度可能T3在之后仍会有进一步增加的可能，需要进一步的研究观察。

下颌扩弓加力过程中，龈沟液中骨硬化蛋白含量的变化能够一定程度上提示加力过程中骨吸收的状态和趋势，但是结合相关的骨形成生物指标变化能够更好的反映骨代谢状态，指导下颌扩弓过程中对力的控制。

此外，有研究[13,14]使用与本实验相同的GCF Scl 采集及检验方法，发现慢性牙周炎患者GCF Scl含量上升，但是与本实验结果相比较, GCF Scl 的含量变化要远大于牙周炎患者，可能是由于GCF Scl 对于力的敏感性要优于慢性炎症，这也为其成为诊断骨吸收有效的生化检验指标提供了可能性。

传统的诊断手段如牙周探诊PD 或X 线诊断等缺乏预见性，Scl 作为骨形成的抑制剂，GCF Scl可能在影像学检查和临床检查发现骨吸收之前便发生改变，并且GCF 的采集无创、方便，易储存，并可以在正畸治疗的各个阶段重复采集。

由此可见，GCF Scl 以其灵敏度高、采集无创、储存方便等优点有望成为一种监测牙槽骨吸收状态的临床上简单易行的生物指标。