实时荧光PCR快速鉴定橘臀纹粉蚧

侯淑玲，朱雅君，刘静远，田沂民，谢小珏，于 翠，叶 军，易建平

(上海海关动植物与食品检验检疫技术中心，上海 200135)

橘臀纹粉蚧Planococcuscitris(Risso)又名橘粉蚧，隶属于同翅目 Homoptera粉蚧科 Pseudococcidae臀纹粉蚧属Planococcus，是热带、亚热带植物的主要害虫[1]，主要为害寄主植物的茎、叶片、花、果等幼嫩部位，轻者可使叶片变黄，重者干枯脱落，严重影响水果的经济价值和观赏性植物的品相[2]。同时，橘臀纹粉蚧与另一种重要的检疫性粉蚧大洋臀纹粉蚧P.minor(Maskell)形态相近，且常在同一种寄主上混合发生，极易混淆，区分两者难度较大，因此建立快速准确鉴定橘臀纹粉蚧的方法十分必要。实时荧光PCR方法相较传统PCR方法具有快速、准确、灵敏度高的优点，适用于实验室对有害生物的快速鉴定。本研究根据橘臀纹粉蚧稳定的特异性片段设计实时荧光Taqman探针，并优化反应条件，以建立橘臀纹粉蚧实时荧光PCR快速鉴定方法，实现对橘臀纹粉蚧的快速鉴定。

1 材料与方法

1.1 标本来源

供试样品材料包括上海市浦东新区葡萄上采集的橘臀纹粉蚧，上海辰山植物园(简称SCSBG)、云南省西双版纳热带植物园(简称XTBG)兰花上采集的橘臀纹粉蚧，以及上海海关(简称SHCC)截获标本上的橘臀纹粉蚧。阴性对照为大洋臀纹粉蚧、南洋臀纹粉蚧P.lilacinus(Cockerell)，为上海海关截获样本，具体信息见表1。所有标本浸泡于无水乙醇中，保存于上海海关动植物与食品检验检疫技术中心植检实验室-20 ℃冰箱中。

表1 试验材料

1.2 参考序列

从GenBank数据库中下载107条臀纹粉蚧属线粒体COI基因序列，具体信息见表2。

表2 参考序列信息

1.3 实时荧光Taqman探针设计及反应条件

使用DNeasy®Blood Tissue Kit(Qiagen，Germany)试剂盒从整头成虫样品中提取DNA。PCR引物为PcoF1/LepR1[3]。PCR反应体系为50 μL，包括：1 μL DNA模板(10 ng)，引物各1 μL(5 μmol/L)，5 μL dNTPs(10 mmol/L)，5 μL 10×PCR buffer(含有Mg2+，TaKaRa Bio.Dalian，China)，Taq DNA polymerase 2 U，ddH2O 37 μL。PCR反应条件为：94 ℃预变性3 min；94 ℃变性30 s，52 ℃退火 30 s，72 ℃延伸1 min，35个循环；72 ℃延伸10 min。产物经1.5%琼脂糖凝胶电泳检测后，送北京六合华大基因科技有限公司上海分公司测序部双向测序，测得PCR产物序列长度为678bp。应用CLUSTX和GENEDOC软件将测序所得DNA序列与GenBank中下载序列进行整理和比对，寻找橘臀纹粉蚧稳定的特异性序列，筛选适合于探针设计的片段。

实时荧光PCR扩增体系为25 μL(TaKaRa，Premix Ex TaqTM试剂盒)：2×Premix Ex Taq 12.5 μL，50×ROX Reference Dye 0.5 μL，上下游引物(5 μmol/L)各1.0 μL，探针(10 μmol/L)1.0 μL，DNA模板2.0 μL，超纯水补至25 μL。利用7500 Real-Time PCR System定量PCR仪进行扩增，反应条件：95℃预变性30 s，95℃ 5s，60℃ 30s，循环40次。每份样品设置2个重复，阴性对照为大洋臀纹粉蚧及南洋臀纹粉蚧，空白对照为超纯水。

1.4 实时荧光Taqman灵敏度检测

将上海辰山植物园采集的样品CS-1a的DNA进行10倍梯度稀释，用数字进行编号，1—7号表示样品CS-1a DNA模板浓度依次稀释10-1、10-2、10-3、10-4、10-5、10-6、10-7倍，每个梯度设置2个重复，引物及探针、反应条件同前，检测实时荧光PCR的灵敏度。样品CS-1a DNA初始浓度为6.33 mg/ μL。

2 结果与分析

2.1 实时荧光Taqman探针设计

通过比对橘臀纹粉蚧及几个近似种的线粒体COI基因序列，最终确定在380 bp左右位置设计探针(图1)。所有探针的荧光标记信号均为FAM，引物分别为PCF3/PCR3，具体内容见表3(引物和探针由上海基康公司合成)。

表3 橘臀纹粉蚧实时荧光PCR引物、探针

2.2 实时荧光PCR扩增

橘臀纹粉蚧特异性探针PC-MGB对供试的24个橘臀纹粉蚧样品均有强的荧光信号增加曲线，表现为阳性扩增，而阴性对照大洋臀纹粉蚧及南洋臀纹粉蚧样品、空白对照则没有检测到荧光信号，表现为阴性，部分样品扩增曲线参照图2。

2.3 灵敏度

荧光信号曲线如图3所示，Ct值(Cycle threshold)分别为1号17.68、2号19.95、3号23.90、4号26.92、5号30.62、6号34.53、7号39.48。由于7号的Ct值>35，无法确定是否为阳性。所以，橘臀纹粉蚧特异性探针PC-MGB的检测限位CS-1a的DNA浓度为6.33×10-5mg/ μL，即63.3 pg/ μL。

3 讨论与结论

由于粉蚧科虫体小，形态鉴别特征不明显，往往需要丰富的经验才能准确鉴定。其种内遗传差异较小，相似度约98.5%—100%，同属内不同种间相似度约85%—93%，应用DNA条形码技术鉴定粉蚧科昆虫具有一定的可行性[4]。目前GenBank中有关粉蚧科的序列数为3 000余条，种类数为400余种，相比较粉蚧科全世界1 400余种差距较大，但随着数据库中序列的不断增加，能够鉴定的种类数将越来越多。许晓东[5]研究了凭祥口岸截获的11种粉蚧及无花果蜡蚧的COI区域序列及28SD2区域序列，任竞妹[6]对粉蚧科23属52种昆虫进行了DNA条形码测序，研究结果均显示DNA条形码基本可以对粉蚧科昆虫进行有效的物种鉴定。但少数粉蚧科种内遗传差异较大，如Ferrisiavirgate种内序列相似度为95.4%[7]，而Ferrisia属内种间相似度可达95.9%，因此不能仅仅根据DNA条形码技术对此种类型进行最终鉴定，应同时辅以形态学特征支持。除了DNA条形码技术外，Saccaggi等[8]应用多重PCR建立了区分橘臀纹粉蚧、无花果刺粉蚧Planococcusficus(Signoret)和拟长尾粉蚧的方法；Rung等[9]基于RFLP技术建立了大洋臀纹粉蚧与橘臀纹粉蚧的检测方法。实时荧光PCR检测在植物有害生物快速检测中是公认的一种快速、稳定、灵敏度高的方法。该方法多应用于病原微生物检测中，在昆虫检测中应用相对较少，Jones等[10]建立了区分B型和Q型烟粉虱Bemisiatabaci(Gennadius)的实时荧光PCR方法；Bass等[11]设计了三重荧光探针用于鉴定传播疟疾的按蚊及其近似种；另外，已针对5种实蝇建立了实时荧光PCR检测方法[12]。但应用实时荧光PCR技术进行粉蚧科昆虫鉴定相对较少，徐浪等[13]应用荧光PCR方法建立了大洋臀纹粉蚧和南洋臀纹粉蚧的快速检测方法，为国内首次将实时荧光PCR技术应用于蚧虫种类鉴定，本文研究内容丰富了该领域研究内容，具有一定应用价值。

橘臀纹粉蚧与大洋臀纹粉蚧不仅在外部形态上近似，分子水平上的差异也较小，依据单个基因位点差异设计的特异性探针常易造成假阳性扩增，这对橘臀纹粉蚧实时荧光特异性Taqman探针的设计造成一定难度。本试验在设计探针之时，选择了具有4个差异位点区段，并选择了其中扩增效率较高，同时重复性好的PCF3/PCR3作为扩增引物，检测准确度高，分析简单快捷，可用于基层实验室橘臀纹粉蚧快速鉴定。且本试验设计的实时荧光PCR引物及探针检测的最低样本浓度可达pg级水平，灵敏度较高。值得注意的是，实际运用时若Ct值在35—40，需浓缩待测样品的DNA浓度，重复进行检测。