利用SNP分子标记构建50份糯玉米自交系DNA指纹库

韩 晴，孙小淋，卢 媛，田 东，施 标，沈雪芳*

(1上海市农业科学院作物育种栽培研究所，CIMMYT：中国特用玉米研究中心，上海 201403；2上海市农业科学院生态环境保护研究所，上海201403)

糯玉米(ZeamaysL.var.ceratinaKulesh)是玉米属的一种类型，起源于中国[1]，富含支链淀粉、赖氨酸、蛋白质等营养物质，具有良好的适口性且营养丰富，深受广大消费者和食品加工企业的欢迎。近年来，通过国家审定的糯玉米品种数量越来越多，其种植面积不断增加，同时也出现套牌侵权、伪劣假种等现象，严重影响种业健康持续发展[2]。

早期的品种鉴别主要依靠形态学方法，这种方法易受人为和环境的影响。随着分子生物学的发展，出现了分子标记技术如RFLP、AFLP、SSR等，该技术不受环境影响，鉴别周期短，被广泛应用于品种鉴定、遗传多样性分析、DNA指纹库构建等。王凤格等[3]利用40对核心SSR引物分析了328个玉米品种的遗传多样性，发现育成的品种遗传多样性指数在不同年份间变化不大。卢媛等[4]利用29对SSR标记对87份糯玉米自交系进行遗传多样性分析，并将其划分为4大类群，各个类群包含种质不同。常利芳等[5]利用40对SSR标记对56份超甜玉米和88份普甜玉米进行聚类分析，共筛选出14个超甜玉米和19个普甜玉米两个亚群体种质，这两个亚群核心种质保留了原始群体的遗传多样性和表型变异，能够代表原始甜玉米材料群体。但采用SSR等分子标记技术构建玉米品种DNA指纹库普遍存在检测位点数量少、标记数量有限和位点突变率高等缺点。SNP标记作为继AFLP、SSR标记后的第三代分子标记，具有分布广泛、呈二态性、通量高、遗传稳定性强和易于自动化分析等优点，已被国际植物新品种权保护联盟(UPOV)推荐用于DNA指纹数据库的构建[6]。目前，SNP标记已应用于油菜[7]、甘蓝[8]、海岛棉[9]等作物指纹库的构建和作物的分子标记辅助育种中[10]，但SNP标记在糯玉米DNA指纹库中的应用很少。本研究利用SNP标记对糯玉米自交系进行基因型分析，并利用核心SNP标记构建糯玉米自交系的DNA指纹库，同时对糯玉米自交系类群进行聚类分析，以期为糯玉米品种确权、遗传多样性分析和育种者权益保护提供理论基础。

1 材料与方法

1.1 试验材料

供试材料为50份糯玉米自交系，由上海市农业科学院玉米遗传育种课题组提供。编号为1—50，品系名称、系谱来源及籽粒性状见表1。

表1 50份供试糯玉米自交系

1.2 DNA提取

将50份自交系种植在人工气候培养箱中，生长到两叶一心时取幼苗叶片。每个品系取5株，混合，采用植物基因组DNA提取试剂盒(离心柱型，TIANGEN DP320)提取幼苗DNA，具体流程参照试剂盒说明书。用1%琼脂糖凝胶电泳对提取样品DNA质量进行检测，要求主带明显、单一，保证DNA的A260/A280值在1.8—2.2。样品DNA置于-20℃保存备用。

1.3 基因分型

利用Illumina公司研发的包含56 110个SNP标记(Illumina，San Diego，California,U.S.A)对供试材料进行基因型分析，按照芯片操作手册进行DNA处理、DNA与芯片杂交、洗脱、单碱基延伸等步骤，将原始数据导入GenomeStudio 软件(V2 011.1，Illumina，Inc.)进行SNP 分型。

用tassel 5.0软件对试验材料基因型进行统计，包括样品的缺失率、杂合率以及SNP的最小等位基因频率(Minor Allele Frequency，MAF)，选出位点检出率大于95%、最小等位基因频率大于0.01、杂合率小于0.05的共42 406个SNP标记用于后续分析。利用位点筛选工具LociScan_V1.0对位点进行梯度筛选。

1.4 聚类分析

用tassel 5.0软件计算各品系之间的遗传距离和遗传相似度，利用NTSYSpc 2.1软件和UPGMA算法进行聚类分析[11]。

2 结果与分析

2.1 SNP标记的分析

利用筛选得到的42 406个SNP标记对50份糯玉米自交系进行SNP分型。99%的位点检出率大于95%，94%的位点检出率超过97%(图1)。说明该芯片对糯玉米自交系SNP位点具有较高的分型效率。42 406个SNP位点在50份糯玉米自交系的杂合率为2%—9%，平均4%，说明自交系纯合度较高；SNP缺失率为0—13%，平均1%，说明SNP芯片质量好；最小等位基因频率(MAF)为0.05—0.55，平均0.40；多态性信息含量(PIC)在0.12—0.46，平均0.38。基因多样性指数变化范围为0.15—0.65，平均0.44。

2.2 DNA指纹库的构建

分别选用8个不同的数量位点，即7 000、8 000、9 000、 10 000、25 000、30 000、35 000、40 000，统计分析位点的识别率。发现这些位点MAF在0.41及以上，杂合率在0.05及以下，PIC在0.31及以上。随着位点数的增加，识别率也越来越高。当达到10 000位点时，识别率为95%；当达到25 000位点时，识别率为98%，以后趋于平缓(表2)。25 000位点时的杂合率0.03，MAF为0.42，PIC均值0.35，98%的糯玉米材料可以被有效区分开。因此，最终选择25 000个核心SNP位点组合构建50个糯玉米品种DNA指纹库(本文未列出)。

表2 SNP核心位点的筛选

2.3 聚类分析

50份自交系两两之间的相似系数在0.38—0.93。18SW-中(编号38)与B红(编号41)、19SW-恒(编号4)与19SW-35(编号5)之间相似系数最大，为0.925，二者之间有6 875个位点的差异。说明18SW-93(编号23)与18SW-OP(编号28)之间亲缘关系要远；18SW-中(编号38)与B红(编号41)、19SW-恒(编号4)与19SW-35(编号5)之间亲缘关系要近。在玉米育种实践中，应尽量避免将亲缘关系近的自交系配组。

在相似系数0.65处，50份糯玉米自交系划分为4大类群。第Ⅰ大群包括19SW-玉、19SW-万、19SW-张、19SW-18、18SW-52等12个糯玉米自交系；第Ⅱ大群包括19SW-恒、19SW-35、19SW-恒6、19SW-苏科、18SW-江恒等11个糯玉米自交系；第Ⅲ大群包括19SW-红、19SW-48、19SW-75、18SW-H、18SW-OP等14个糯玉米自交系；第Ⅳ大群包括19SW-玉、19SW-31、18SW-甜糯、18SW-彩甜糯、申-3等13个糯玉米自交系。聚类结果与各类群的籽粒颜色表现和系谱来源均一致，如第一大类群籽粒颜色均为白色，组合父本为‘万糯2000’；第二大类群籽粒颜色均为紫白色，组合父本为‘恒♀-2’；第三大类群籽粒颜色均为红色，组合父本为‘红w’；第四大类群籽粒颜色均为五彩色，组合父本为‘w93’。

3 讨论与结论

SNP分子标记技术被国际植物品种权保护联盟指定为构建DNA指纹数据库的标记方法之一，具有与功能基因关联度高、自动化程度高、样品检测通量高等优点。现在已经被广泛用于玉米DNA指纹库的构建、遗传距离和遗传相似度的分析[12]。

目前，在玉米研究中应用比较多的SNP标记有600K、50K、5K、3K、1K等，SNP标记在基因组中密度高且分布均匀，是最具发展潜力的建库标记之一[13-14]。本研究采用的Illumina公司开发的包含56 110个SNP标记属于高密度SNP标记。通过软件计算得出所选SNP标记的PIC均值为0.35，按照PIC>0.5为高度多态性；0.25

通过设置8个不同数量位点梯度筛选核心标记，可节约检测成本，提高品种鉴别的准确度。梯度筛选分析表明，当数量位点为7 000时，供试材料的识别率就可达85%，对于亲缘关系较远的品种，可选择7 000个SNP位点结合定点测序的方法进行鉴定；当数量位点达到25 000时，供试材料间的识别率高达98%，对亲缘关系较近的品种，需要结合高通量测序技术进行区分。本研究筛选SNP核心位点组合，可为糯玉米自交系指纹库构建、遗传多样性分析和种质资源评价等研究提供参考依据。

聚类结果表明，50份糯玉米自交系被划分为四大类群。通过系谱分析和农艺性状比较，发现聚类结果与系谱来源较一致。如品系18SW-中与18SW-56籽粒颜色都是红色，穗型都是筒锥型，株型一致；品系18SW-中与18SW-56的父本是同一个父本，都是‘红w’。说明SNP标记技术能够根据亲缘关系远近，准确划分糯玉米自交系。