阿萨伊及其醇提物对虚热及虚寒证小鼠甲状腺素及代谢水平的影响

周雪 乐娜 王玉杰 研 汤如莹 王林元 张建军

摘要 目的：通過考察阿萨伊醇提物对虚热及虚寒证小鼠的温度趋向性、环核苷酸、甲状腺素及代谢水平的影响，探讨阿萨伊寒凉药性的物质基础。方法：将昆明种雄性小鼠随机分为空白组、虚热模型组、虚热+阿萨伊冻干原粉组、虚热+阿萨伊醇提物组、虚寒模型组、虚寒+肉桂组、虚寒+阿萨伊冻干原粉组、虚寒+阿萨伊醇提物组。虚热模型组小鼠每天下午灌胃给予甲状腺片溶液160 mg/kg，虚寒模型组小鼠给予氢化可的松溶液25 mg/kg，连续14 d，各给药组灌胃相应药物，实验结束后测定相关指标。结果：阿萨伊醇提物与寒凉性质的阿萨伊作用类似，与温热性质的肉桂作用相反，对虚热模型小鼠作用比较明显，而对虚寒模型无明显改善作用。结论：该实验采用同类比较，异类反证的方法，通过测定动物温度趋向性、环核苷酸、甲状腺激素与能量代谢水平等相关指标的含量变化，证明了阿萨伊醇提物为阿萨伊寒凉药性的物质基础。

关键词 阿萨伊;阿萨伊醇提物;环核苷酸;温度趋向性;甲状腺素;代谢水平;物质基础

Effects of ANai Alcohol Extract on Thyroxine and Metabolic Level of Deficiency-Heat and Deficiency-Cold Syndrome in Mice

ZHOU Xue，LE Na，WANG Yujie， QU Yan， TANG Ruyin， WANG Linyuan， ZHANG Jianjun

（Beijing University of Chinese Medicine， Beijing 100029， China）

Abstract Objective：To investigate the temperature tendency， cyclic nucleotides， thyroxine and metabolic level of Aaí alcohol extract on deficiency-heat and deficiency-cold models and to clarify the material basis of the cool drug properties of the Aaí.Methods：KM mice were randomly divided into a blank group， a deficiency-heat model group， a deficiency-heat+Aaí group， a deficiency-heat+Aaí alcohol extract group， a deficiency-cold model group， a deficiency-cold+Cortex Cinnamomi group， a deficiency-cold+Aaí group， a deficiency-cold+Aaí alcohol extract group.The mice were administered orally at the dose of 160 mg/kg thyroxine and 25 mg/kg hydrocortisone on the afternoon from the first day per day respectively for 14 days to induce deficiency-heat and deficiency-cold models.Each administration group was given the corresponding drug.At the end of the experiment， the related indexes were determined.Results：Aaí alcohol extract had the same effect with Aaí on deficiency-heat model.In contrast to Cortex Cinnamomi， there was no significant effect on the deficiency-cold model.Conclusion：In this study， the content changes of temperature tendency， cyclic nucleotide， thyroid hormone， metabolism and other related indicators were preliminarily determined to prove that the alcohol extract of Aaí is the material basis of Aaí cold medicine by the methods of homogeneous comparison and heterogeneous disproval.

Keywords Aaí; Aaí alcohol extract; Cyclic nucleotides; Temperature tendency; Thyroxine; Metabolic level; Material basis

中图分类号：R284文献标识码：Adoi：10.3969/j.issn.1673-7202.2020.01.009

阿萨伊为来源于棕榈科植物阿萨伊棕榈树（Euterpe oleraceae Mart.）的新鲜果实，又名巴西莓，原产于南美地区[1]。2013年阿萨伊由国家卫生部引入中国[2]。我们依据中药新资源药性研究模式[3]，在密切追踪阿萨伊现代研究进展基础上，对其文献采用数据库技术进行全面整理并首次对阿萨伊进行系统的中医药理论分析，提出了阿萨伊的中药药性为凉，药理学验证了阿萨伊的寒凉药性[4]。为了进一步探讨阿萨伊寒凉药性的物质基础，对阿萨伊的化学成分进行提取分离，得到的醇提物中主要含花青素类和黄酮类成分，均具有很强的抗氧化、抗炎等作用。该实验研究了阿萨伊醇提物对虚热及虚寒证小鼠的温度趋向性动物行为学表征、环核苷酸、甲状腺素及代谢水平等生化指标的影响，以探讨阿萨伊药性的物质基础。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 动物 SPF级昆明种雄性小鼠112只，体质量18～22 g，购自斯贝福（北京）生物技术有限公司（许可证号：SCXK（京）2016-0002）。小鼠饲养于北京中医药大学动物房，整个实验过程中小鼠自由饮水，室温22～26 ℃，相对湿度为60%～70%，灯照周期为12 h。

1.1.2 药物 1）受试药物：阿萨伊冻干原粉，由蒙维（上海）贸易有限公司提供。2）阿萨伊醇提物：取阿萨伊冻干原粉，经超临界CO2萃取仪脱脂后，加入10倍量80%乙醇，超声提取3次，每次超声1 h，滤过，合并滤液，回收乙醇至无醇味，并配制成每毫升相当于0.2 g阿萨伊冻干原粉的受试物。3）造模药：甲状腺片（上海长城药业有限公司，批号：20161101）;氢化可的松琥珀酸钠（天津生物化学制药有限公司，批号：021511075）。4）阳性药：肉桂配方颗粒（北京康仁堂药业有限公司，批号：16012323），实验前用蒸馏水或生理盐水配制成所需要的浓度。

1.1.3 试剂与仪器 环磷酸腺苷（cAMP）、环磷酸鸟苷（cGMP）放射免疫试剂盒（北京华英生物技术研究所，批号20180126），三碘甲状腺原氨酸（T3）、甲状腺素（T4）放射免疫试剂盒（北京华英生物技术研究所，批号20180126），游离脂肪酸（FFA）试剂盒（北京华英生物技术研究所，批号20180126），总蛋白（TP）、白蛋白（ALB）试剂盒（中生北控生物科技股份有限公司，批号20180126），总胆固醇（TC）、三酰甘油（TG）试剂盒（中生北控生物科技股份有限公司，批号20180126）。DR-200BS酶标分析仪（无锡华卫德朗仪器有限公司）;BS-420全自动生化仪（深圳迈瑞生物医疗电子股份有限公司）;XH-6020全自动放免计数仪（西安核仪器厂）;动物温度趋向性行为学智能监测系统由解放军302医院自主设计（专利号ZL200820004444.2）（北京中交仪器公司协助研发）。

1.2 方法

1.2.1 分组与模型制备 小鼠适应性喂养5 d，随机分为空白组、虚热模型组、虚热+阿萨伊冻干原粉组（4 g/kg）、虚热+阿萨伊醇提物组（折合生药4 g/kg）、虚寒模型组、虚寒+肉桂组（37.5 g/kg）、虚寒+阿萨伊冻干原粉组（4 g/kg）、虚寒+阿萨伊醇提物组（折合生药4 g/kg）8组，每组14只，每组分为两笼饲养。实验第1天开始，虚热模型组小鼠每天下午灌胃给予甲状腺片溶液160 mg/kg，虚寒模型组小鼠灌胃给予氢化可的松溶液25 mg/kg，1次/d，连续14 d，实验第12、13、14天连续3 d测定小鼠温度趋向性，第15天摘眼球取血，颈椎脱臼处死动物。

1.2.2 给药方法 边造模边给药，给药体积为每10克体质量0.2 mL，按体质量变化调整灌胃量。空白组和虚热模型、虚寒模型组给予等量生理盐水，各组灌胃相应浓度的药物，每日上午1次，共14 d。

1.2.3 检测指标与方法 1）观察实验小鼠一般情况，体质量变化等;2）基于冷热板示差法研究小鼠灌胃给药后的温度趋向性差异，即小鼠冷区/热区停留比例;3）小鼠摘眼球取血，静置2～3 h，3500 r/min离心15 min，吸取上层血清，采用放射免疫、比色等方法检测各组小鼠血清中环磷酸腺苷（cAMP），环磷酸鸟苷（cGMP），cAMP/cGMP，三碘甲状腺原氨酸（T3），甲状腺素（T4），游离脂肪酸（FFA），总胆固醇（TC），三酰甘油（TG），总蛋白（TP），白蛋白（ALB）等指標的变化，因小鼠血清样本有限，故每组血清样本按笼数即7只分为两部分检测不同指标。

1.3 统计学方法

采用SPSS 20.0统计软件进行数据分析，计量资料以均值±标准差（±s）表示，数据进行正态性和方差齐性检验，方差齐时组间数据采用单因素方差分析法，两两比较采用LSD法，方差不齐时采用Dunnett′s进行分析，以P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 对小鼠一般状况的影响

与空白组比较，虚热模型组小鼠出现大便干硬、小便发黄、自主活动增加、易被激惹、反应活跃等虚热症状。虚寒模型组小鼠出现明显消瘦、毛发无光泽、反应迟钝、大便清稀、畏寒喜暖等虚寒症状。虚热阿萨伊组对虚热模型组以及虚寒肉桂组对虚寒模型组均有一定程度的改善，虚热阿萨伊醇提物组对虚热模型以及虚寒阿萨伊醇提物组虚寒模型组小鼠也有不同程度的改善。

2.2 阿萨伊及阿萨伊醇提物对虚热模型、虚寒模型组小鼠体质量的影响

与空白组比较，实验第14天，虚热模型组体质量有明显下降，差异有统计学意义（P<0.05）;与虚热模型组比较，虚热阿萨伊组有所回升，差异有统计学意义（P<0.05），虚热阿萨伊醇提物组也有所提高，差异有统计学意义（P<0.05）。

与空白组比较，实验第7天、第14天，虚寒模型组体质量明显下降，差异有统计学意义（P<0.05）;与虚寒模型组比较，虚寒肉桂组体质量高于模型组，差异有统计学意义（P<0.05）。见表1。

2.3 阿萨伊及阿萨伊醇提物对虚热模型、虚寒模型组小鼠温度趋向性及环核苷酸水平的影响

与空白组比较，虚热模型组冷区比例明显上升，差异有统计学意义（P<0.05）;与虚热模型组比较，虚热阿萨伊组冷区比例显著下降，差异有统计学意义（P<0.05），而虚热阿萨伊醇提物组与虚热阿萨伊组类似，亦能降低冷区停留比例，差异有统计学意义（P<0.05）;与空白组比较，虚热模型组cAMP、cGMP、cAMP/cGMP均明显升高，差异有统计学意义（P<0.05）;与虚热模型组比较，虚热阿萨伊组cAMP、cGMP、cAMP/cGMP值均明显降低，差异有统计学意义（P<0.05），虚热阿萨伊醇提物组也能明显降低cAMP、cGMP、cAMP/cGMP值，差异有统计学意义（P<0.05）。

与空白组比较，虚寒模型组冷区比例明显下降，差异有统计学意义（P<0.05），与虚寒模型组比较，虚寒肉桂组有所上升，差异有统计学意义（P<0.05）;与空白组比效，虚寒模型组cAMP、cAMP/cGMP均明显下降，差异有统计学意义（P<0.05），cGMP明显上升，差异有统计学意义（P<0.05）;与虚寒模型组比较，虚寒肉桂组cGMP明显下降，差异有统计学意义（P<0.05）。见表2。

2.4 阿萨伊及阿萨伊醇提物对虚热模型、虚寒模型组小鼠甲状腺激素水平的影响

与空白组比较，虚热模型组T3明显上升，差异有统计学意义（P<0.05）;与虚热模型组比较，虚热阿萨伊组T3显著下降，差异有统计学意义（P<0.05），虚热阿萨伊醇提物组与虚热阿萨伊组类似，T3、T4均显著下降，差异有统计学意义（P<0.05）。

与空白组比较，虚寒模型组T3、T4均有下降的趋势;与虚寒模型组比较，虚寒肉桂组有升高的趋势，虚寒阿萨伊组无变化，虚寒阿萨伊醇提物组T3、T4差异无统计学意义（P>0.05）。见表3。

2.5 阿萨伊及阿萨伊醇提物对虚热模型、虚寒模型组小鼠代谢水平的影响

与空白组比较，虚热模型组TC、TG、TP、FFA及白蛋白含量均明显升高，差异有统计学意义（P<0.05）;与虚热模型组比较，虚热阿萨伊组TC、TG、TP及白蛋白显著下降，差异有统计学意义（P<0.05），虚热阿萨伊醇提物组TC、TG、TP、FFA及白蛋白也均显著下降，差异有统计学意义（P<0.05）。

与空白组比较，虚寒模型组TC、FFA及白蛋白含量均显著下降，差异有统计学意义（P<0.05）;与虚寒模型组比较，虚寒肉桂组TC、FFA及白蛋白均有所回升，差异有统计学意义（P<0.05），阿萨伊组差异无统计学意义（P>0.05），虚寒阿萨伊醇提物组FFA有所上升，差异有统计学意义（P<0.05）。见表4。

3 讨论

《神农本草经》云：“药有寒热温凉”。中药的寒热属性主要是从药物作用于人体所获得的不同反应总结而来，人体的寒热变化可以通过药性的寒热温凉来进行调节;药物的作用也是从药物临床疗效总结而得，“寒者热之，热者寒之”，从而纠正机体阴阳偏盛或偏衰的病理状况。因而，病证的寒热属性是用药的主要依据[5]。寒热药性的研究与中医寒热证候本质研究紧密相关，因此在动物实验研究中，构建能够体现临床特征的动物证候模型尤为关键。根据文献方法，以及前期实验结果验证，选取灌胃160 mg/kg的甲状腺素和25 mg/kg的氢化可的松，连续14 d的方法诱导虚热及虚寒模型[6-7]。

近年来，中药药性的研究成为热点，有诸多学者运用多种方法，从不同角度对药性理论展开了研究。有学者提出“药性三要素”观点，认为中药的物质基础作用于不同证候的动物而对其宏观行为学及微观生化指标的改变情况[8]。阴阳的偏盛偏衰使机体表现出寒热证候，此时在机体对温度的感知以及伴随的行为等方面均会出现差异，如体温、自主活动和对外界冷热刺激的反应等。研究表明，机体环核苷酸水平、甲状腺功能状态及能量代谢水平等方面的不同，是造成寒热證候存在不同外在表征的内在生理基础，治疗时可以遵循“疗寒者热药，疗热者寒药”的用药原则，利用寒热性中药进行干预、调节机体功能，使相关指标从紊乱状态恢复正常，从而达到调整寒热体质或纠正寒热证候的效果，以发挥中药的有效性[9]。

实验以宏观动物行为学和动物热活性角度为研究的切入点，结合计算机和现代影像处理技术，通过监测虚热、虚寒证模型小鼠给予阿萨伊醇提物后对环境温度趋向性行为的变化来评价阿萨伊醇提物的寒热属性。在本实验中虚热模型组冷区比例升高，虚热阿萨伊及虚热阿萨伊醇提物组均能使冷区比例下降，而虚寒阿萨伊及其醇提物对虚寒模型的冷区比例下降情况均无明显改善作用，故从温度趋向性看，阿萨伊醇提物性偏凉。研究表明环核苷酸水平可作为中药寒热药性筛选的指标，其中有研究发现虚热模型组cAMP、cAMP/cGMP均有所升高[10]，有研究在临床研究中发现阳虚患者血浆cAMP降低，cGMP升高，cAMP/cGMP比值下降[11]。本研究中虚热模型组cAMP、cGMP、cAMP/cGMP均代谢亢奋，虚热阿萨伊、虚热阿萨伊醇提物组均能抑制cAMP、cGMP、cAMP/cGMP水平。又因本实验采用灌胃甲状腺激素制备虚热模型，故虚热模型组T3、T4有所升高，虚热阿萨伊及虚热阿萨伊醇提物组均能抑制T3、T4水平。当机体处于虚热状态时除了激素分泌水平升高外，代谢功能也会增强，蛋白质、糖、脂代谢相关指标合成增加，而在虚寒状态时则合成相对不足[12]。本实验中虚热模型组TC、TG、TP、FFA及白蛋白水平有所升高，虚热阿萨伊及虚热阿萨伊醇提物组均能不同程度的降低其水平，而虚寒阿萨伊及其醇提物对虚寒模型组相关指标的紊乱状态均无明显的改善作用。从环核苷酸、甲状腺激素及代谢水平等指标变化情况来看，阿萨伊醇提物性偏凉。

综上所述，本实验通过制备虚热、虚寒动物证候模型来“以证测性”，从体质量、温度趋向性等动物行为学角度，环核苷酸水平、甲状腺激素及代谢水平等内在生化指标等多方面来研究阿萨伊醇提物的寒热药性特点，结果表明阿萨伊醇提物与寒凉性质的阿萨伊作用类似，与温热性质的肉桂相反，对虚热模型小鼠作用比较明显，而对虚寒模型无明显改善作用，因此按同类比较异类反证的方法推断阿萨伊醇提物为阿萨伊寒凉药性的物质基础，阿萨伊中的其他类型的化学成分药性如何还有待进一步实验探索。

参考文献

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[11]邝安堃，丁霆，陈家伦，等.阳虚（甲状腺功能减退）和阴虚（甲状腺功能亢进）病人血浆环核苷酸的对比[J].中醫杂志，1979，25（7）：21-24.

[12]陈继东，陈如泉.论甲状腺的中医脏腑属性及功能特点[J].湖北中医药大学学报，2018，20（1）：5-9.

（2019-04-12收稿 责任编辑：杨觉雄）

基金项目：国家自然科学基金项目（81173569）;北京中医药大学中青年教师自主课题（2018-JYBZZ-JS028、2016-JYB-JSPY-013）;北京中医药大学在读研究生项目（2015-JYB-XS002）作者简介：周雪（1993.08—），女，硕士研究生在读，研究方向：中医临床药学，E-mail：13810986307@163.com通信作者：张建军（1965.08—），女，博士，研究员，博士研究生导师，研究方向：基于中药基本理论与临床应用的药效机理及物质基础研究，E-mail：zjj59@163.com